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        生物資訊

        細胞培養的基本原理與技術 體外培養的概念

        作者:admin 來源:本站 發布時間: 2016-03-23 15:14  瀏覽次數:
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        第一章 細胞培養的基本原理與技術

        現代生物技術一般認為包括基因工程技術、細胞工程技術、酶工程技術和發酵工程技術,而這些技術的發展幾乎都與細胞培養有密切關系,特別是在醫藥領域的發展,細胞培養更具有特殊的作用和價值。比如基因工程藥物或疫苗在研究生產過程中很多是通過細胞培養來實現的?;蚬こ桃腋我呙绾芏嗍且?/span>CHO細胞作為載體;細胞工程中更是離不細胞培養,雜交瘤單克隆抗體,完全是通過細胞培養來實現的,既使是現在飛速發展的基因工程抗體也離不開細胞培養。正在倍受重視的基因治療、體細胞治療也要經過細胞培養過程才能實現,發酵工程和酶工程有的也與細胞培養密切相關??傊?,細胞培養在整個生物技術產業的發展中起到了很關鍵的核心作用。
        第一節體外培養的概念
        一、基本概念體外培養(invitroculture),就是將活體結構成分或活的個體從體內或其寄生體內取出,放在類似于體內生存環境的體外環境中,讓其生長和發育的方法。
        組織培養:是指從生物體內取出活的組織(多指組織塊)在體外進行培養的方法。
        細胞培養:是指將活細胞(尤其是分散的細胞)在體外進行培養的方法。
        器官培養:是指從生物體內取出的器官(一般是胚胎器官)、器官的一部分或器官原基在體外進行培養的方法。
        二、體內、外細胞的差異和分化
        1.差異:細胞離體后,失去了神經體液的調節和細胞間的相互影響,生活在缺乏動態平衡相對穩定環境中,日久天長,易發生如下變化:分化現象減弱;形態功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡;或發生轉化獲得不死性,變成可無限生長的連續細胞系或惡性細胞系。因此,培養中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體,它們既保持著與體內細胞相同的基本結構和功能,也有一些不同于體內細胞的性狀。實際上從細胞一旦被置于體外培養后,這種差異就開始發生了。
        2.分化:體外培養的細胞分化能力并未完全喪失,只是環境的改變,細胞分化的表現和在體內不同。細胞是否表現分化,關鍵在于是否存在使細胞分化的條件,如Friend細胞(小鼠紅白血病細胞)在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白,血管內皮細胞在類似基膜物質底物上培養時能長成血管狀結構,雜交瘤細胞能產生特異的單克隆抗體,這些均屬于細胞分化行為。
        第二節細胞培養的一般過程
        一、準備工作準備工作對開展細胞培養異常重要,工作量也較大,應給予足夠的重視,推備工作中某一環節的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒,培養基與其他試劑的配制、分裝及滅菌,無菌室或超凈臺的清潔與消毒,培養箱及其他儀器的檢查與調試。
        二、取材在無菌環境下從機體取出某種組織細胞(視實驗目的而定),經過一定的處理(如消化分散細胞、分離等)后接入培養器血中,這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培養稱為原代培養。
        理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用于培養,實際上幼體組織(尤其是胚胎組織)比成年個體的組織容易培養,分化程度低的組織比分化高的容易培養,腫瘤組織比正常組織容易培養。取材后應立即處理,盡快培養,因故不能馬上培養時,可將組織塊切成黃豆般大的小塊,置4℃的培養液中保存。取組織時應嚴格保持無菌,同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌,為減少污染可用抗菌素處理。
        三、培養將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養。如系組織塊培養,則直接將組織塊接入培養器皿底部,幾個小時后組織塊可貼牢在底部,再加入培養基。如系細胞培養,一般應在接入培養器皿之前進行細胞計數,按要求以一定的量(以每毫升細胞數表示)接入培養器皿并直接加入培養基。細胞進入培養器皿后,立即放入培養箱中,使細胞盡早進入生長狀態。
        正在培養中的細胞應每隔一定時間觀察一次,觀察的內容包括細胞是否生長良好,形態是否正常,有無污染,培養基的PH是否太酸或太堿(由酚紅指示劑指示),此外對培養溫度和CO2濃度也要定時檢查。
        原代培養一般有一段潛伏期(數小時到數十天不等),在潛伏期細胞一般不分裂,但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底后要進行傳代培養,將一瓶中的細胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續培養。每傳代一次稱為一代。二倍體細胞一般只能傳幾十代,而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質,也可能僅有不死性(Immortality)而無惡性。
        四、凍存及復蘇(可參閱后面有關章節)為了保存細胞,特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株,要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度-196℃,將細胞收集至凍存管中加入含保護劑(一般為二甲亞砜或甘油)的培養基,以一定的冷卻速度凍存,最終保存于液氮中。在極低的溫度下,細胞保存的時間幾乎是無限的。復蘇一般采用快融方法,即從液氮中取出凍存管后,立即放入37℃水中,使之在一分鐘內迅速融解。然后將細胞轉入培養器皿中進行培養。
        凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。
        五、常用儀器設備無菌室,超凈工作臺,三重純水蒸餾器,抽氣泵,壓力蒸氣消毒器,電熱恒溫培養箱,培養器具,CO2培養箱,恒溫水浴鍋,倒置顯微鏡,離心機,無菌過濾器,洗刷裝置,細胞計數板和電子細胞技術儀等等。
        第三節細胞培養的無菌環境
        一、無菌室
        無菌室的結構:一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。
        無菌室的消毒和防污染:為保持無菌狀態,經常消毒是必要的,通常采用每日(使用前)紫外照射(12小時),每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸(2小時)和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒。實際工作中,要根據無菌室建筑材料的差異來選擇合適的消毒方法。
        此外,還應注意防止無菌室的污染。造成無菌室污染的可能包括:送入無菌室的風沒有被過濾除菌;進出無菌室時,能使外界空氣直接對流進無菌室的操作間;等。
        二、超凈工作臺
        工作原理:鼓風機驅動空氣通過高效過濾器得以凈化,凈化的空氣被徐徐吹過臺面空間而將其中的塵埃、細菌甚至病毒顆粒帶走,使工作區構成無菌環境。根據氣流在超凈工作臺的流動方向不同,可將超凈工作臺分為側流式、直流式和外流式三種類型。
        超凈臺的使用與保養:超凈臺的平均風速保持在0.32-0.48/秒為宜,過大、過小均不利于保持凈化度;使用前最好開啟超凈臺內紫外燈照射1030分鐘,然后讓超凈臺預工作1015分鐘,以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態;使用完畢后,要用70%酒精將臺面和臺內四周擦拭干凈,以保證超凈臺無菌。還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺。
        第四節常用培養器皿及清洗消毒
        細胞培養需要大量消耗性物品,如玻璃器皿、金屬器皿、塑料、橡膠制品、布類、紙類等,因此掌握清洗、消毒知識,學會清洗、消毒方法是從事細胞培養工作必須的。
        一、清洗離體條件下,有害物質直接同細胞接觸,細胞對任何有害物質十分敏感,極少殘留物都可以對細胞產生毒副作用。因此,新的或重新使用的器皿都必須認真清洗,達到不含任何殘留物的要求。
        (一)玻璃器皿的清洗一般經過浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個步驟。
        1.浸泡:新的或用過的玻璃器皿要先用清水浸泡,軟化和溶解附著物。新玻璃器皿使用前得先用自來水簡單刷洗,然后用5%鹽酸浸泡過夜;用過的玻璃器皿往往附有大量蛋白質和油脂,干涸后不易刷洗掉,故用后應立即浸入清水中備刷洗。
        2.刷洗:將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中,用軟毛刷反復刷洗。不要留死角,并防止破壞器皿表面的光潔度。將刷洗干凈的玻璃器皿洗凈、晾干,備浸酸。
        3.浸酸:浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中,又稱酸液,通過酸液的強氧化作用清除器皿表面的可能殘留物質。浸酸不應少于六小時,一般過夜或更長。放取器皿要小心。
        4.沖洗:刷洗和浸酸后的器皿都必須用水充分沖洗,浸酸后器皿是否沖洗的干凈,直接影響到細胞培養的成敗。手工洗滌浸酸后的器皿,每件器皿至少要反復注水-倒空”15次以上,最后用重蒸水浸洗23次,晾干或烘干后包裝備用。
        (二)橡膠制品清洗
        新的橡膠制品洗滌方法:0.5mol/LNaOH煮沸15分鐘,流水沖洗,0.5mol/LHCl煮沸15分鐘,流水沖洗,自來水煮沸2次,蒸餾水煮沸20分鐘,50℃烤干備用。
        (三)塑料制品的清洗
        塑料制品特點:質軟、易出現劃痕;耐腐蝕能力強、但不耐熱。
        清洗程序:使用器皿后立即用清水清洗,浸于自來水過夜,用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗,流水沖洗,晾干,浸于清潔液15分鐘,流水沖洗(1520遍),蒸餾水浸洗三次,雙蒸水泡24小時,晾干備用。
        (四)包裝:對細胞培養用品進行消毒前,要進行嚴密包裝,以便于消毒和貯存。常用的包裝材料:牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、較大培養皿等,近幾年用鋁箔包裝,非常方便,適用。培養皿、注射器、金屬器械等用牛皮紙包裝后再裝入飯盒內,較大的器皿可以進行局部包扎。
        二、消毒和滅菌微生物污染是造成細胞培養失敗的主要原因
        (一)物理消毒法
        1.紫外線消毒:紫外線是一種低能量的電磁輻射,可殺死多種微生物。革蘭陰性菌最為敏感,其次是陽性菌,再次為芽孢,真菌孢子的抵抗力最強。紫外線的直接作用是通過破壞微生物的核酸及蛋白質等而使其滅活,間接作用是通過紫外線照射產生的臭氧殺死微生物。直接照射培養室消毒,用法簡單,效果好。
        紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強度和照射劑量呈正相關,輻射強度隨燈距離增加而降低,照射劑量和照射時間呈正比。因此紫外燈同被照射物的距離和照射時間要適合。離地面2米的30W燈可照射9平方米房間,每天照射23小時,期間可間隔30分鐘。燈管離地面2米以外要延長照射時間,2.5米照射效果較差。紫外燈照射工作臺的距離不應超過1.5米,照射時間30分鐘為宜。
        紫外燈不僅對皮膚、眼睛傷害,且對培養細胞與試劑等也產生不良影響,因此,不要開著紫外等操作。
        2.高溫濕熱滅菌:壓力蒸汽滅菌是最常用的高溫濕熱滅菌方法。對生物材料有良好的穿透力,能造成蛋白質變性凝固而使微生物死亡。布類、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培養液都可以用這方法滅菌。
        不同壓力蒸汽所達到的溫度不同,不同消毒物品所需的有效消毒壓力和時間不同。從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品(不包括液體),應立即放到60-70℃烤箱內烘干,再貯存備用,否則,潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。煮沸消毒也是常用的濕熱消毒方法,它具有條件簡單、使用方便等特點。
        3.高溫干熱消毒:干熱滅菌主要是將電熱烤箱內物品加熱到160℃以上,并保持90120分鐘,殺死細菌和芽孢,達到滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿(如體積較大的燒杯、培養瓶)、金屬器皿以及不能與蒸汽接觸的物品(如粉劑、油劑)。
        干熱滅菌后要關掉開關并使物品逐漸冷卻后在打開,切忌立即打開,以免溫度驟變而使箱內的玻璃器皿破裂。干烤箱內物品間要有空隙,物品不要靠近加熱裝置。
        燒灼也是滅菌方法之一,常利用臺面上的酒精燈的火焰對金屬器皿及玻璃器皿口緣進行燒灼消毒。
        4.過濾除菌:是將液體或氣體用微孔薄膜過濾,使大于孔徑的細菌等微生物顆粒阻留,從而達到除菌目的。在體外培養時,過濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養液。目前,大多實驗室采用微孔濾膜濾器除菌。關鍵步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。
        (二)化學消毒:新潔而滅,其0.1%水溶液可對器械、皮膚、操作表面進行擦拭和浸泡消毒。
        (三)抗生素消毒:抗生素主要用于消毒培養液,是培養過程中預防微生物污染的重要手段,也是微生物污染不嚴重時的急救方法。不同抗生素殺滅微生物不同,應根據需要選擇。
        可用于細胞培養的消毒滅菌方法很多,但每種方法都有一定的適應范圍。如常用的過濾除菌系統、紫外照射、電子殺菌燈、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒實驗室空氣;多用新潔而滅消毒實驗室地面;常用干熱、濕熱消毒劑浸泡、紫外照射等方法消毒培養用器皿;采用高壓蒸汽滅菌或過濾除菌方法消毒培養液。
        第二章細胞培養液
        現代生物技術均通過細胞作為載體來進行,無論是基因治療、干細胞、克隆技術都在細胞內進行的。細胞的生長需要一定的營養環境,用于維持細胞生長的營養基質稱為培養基,即指所有用于各種目的的體外培養、保存細胞用的物質,就其本意上講為人工模擬體內生長的營養環境,使細胞在此環境中有生長和繁殖的能力。它是提供細胞營養和促進細胞生長增殖的物質基礎。細胞培養基其組成成分主要有:水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子及其他一些入核酸降解物、激素等。
        隨著動物細胞大規模培養技術的迅速發展,作為細胞培養領域中最基本的原料-細胞培養基的用量也迅速增加,被廣泛應用于細胞生物學科和醫學研究的各個領域,如疫苗生產(人用疫苗如乙腦、狂犬、甲肝、乙肝、出血熱、麻疹等,獸用疫苗如口蹄、馬立克、偽狂犬等),基因藥物生產(如EPO、TPA等),臨床用單抗(如抗人肝癌單抗、抗人肺單抗、WT3)等。
        第一節水與平衡鹽溶液
        1.培養用水:體外培養的細胞對水質特別敏感,對水的純度要求較高。培養用水中如果含有一些雜質,即使含量極微,有時也會影響細胞的存活和生長,甚至導致細胞死亡。用金屬蒸餾器制備的蒸餾水,可能會含有某些金屬離子,一般不作為培養用水。配制培養用液應使用經石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水。最好用龍頭瓶貯存,存放時間一般不應超過2周。
        2.緩沖溶液、生理鹽水、平衡鹽溶液:稍后介紹。
        第二節細胞培養基的基本要求
        體外培養的細胞直接生活在培養基中,因此培養基應能滿足細胞對營養成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。
        一、營養成分維持細胞生長的營養條件一般包括以下幾個方面:
        1.氨基酸:是細胞合成蛋白質的原料。所有細胞都需要12種必須氨基酸:纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺,它在細胞代謝過程中有重要作用,所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來源,同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質。體外培養的各種培養基內都含有必需氨基酸。
        2.單糖:培養中的細胞可以進行有氧與無氧酵解,六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細胞對葡萄糖的吸收能力最高,半乳糖最低。
        體外培養動物細胞時,幾乎所有的培養基或培養液中都以葡萄糖作為必含的能源物質。
        3.維生素:主要扮演輔酶、輔基的角色,必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養基常有的成分。
        4.無機離子與微量元素:細胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素,還需要微量元素,如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。
        二、促生長因子及激素已證實:各種激素、生長因子對于維持細胞的功能、保持細胞的狀態(分化或未分化)具有十分重要的作用。有些激素對許多細胞生長有促生長作用,如胰島素,它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細胞有明顯促進作用,如氫化可的松可促進表皮細胞的生長,泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。
        三、滲透壓細胞必須生活在等滲環境中,大多數培養細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg,可視為培養人體細胞的理想滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數哺乳動物細胞,滲透壓在260320mOsm/kg的范圍都適宜。
        四、pH氣體也是細胞生存的必需條件之一,所需氣體豐要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸循環,產生能量供給細胞生長、增殖和合成各種成分。一些細胞在缺氧情況下,借糖酵解也可獲取能量,但多數細胞缺氧不能生存。在開放培養時,一般置細胞于95%空氣加5%二氧化碳的混合氣體環境中培養。二氧化碳既是細胞代謝產物,也是細胞所需成分,它主要與維持培養基的pH有直接關系。動物細胞大多數需要輕微的堿性條件,pH值約在72~74℃在細胞生長過程中,隨細胞數量的增多和代謝活動的加強,二氧化碳不斷被釋放,培養液變酸,PH值發生變化。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳,很不穩定,致使緩沖系統難以精確地控制。故這一緩沖系統適合密閉培養。HEPES結合碳酸氫鈉使用,可提供更有效的緩沖體系,主要是防止pH值迅速變動,但最大缺點是在開放培養或觀察時難以維持正常的pH值。造成pH波動主要是代謝產生的CO2,在封閉式培養過程中CO2與水結合產生碳酸,培養基pH很快下降。為解決這一問題,合成培養基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統,并采用開放培養,使細胞代謝產生的CO2及時溢出培養瓶,再通過穩定調節溫箱中CO2濃度(5%),與培養基中的NaHCO3處于平衡狀態。
        五、無毒、無污染體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質沒有抵抗能力,因此培養基應達到無化學物質污染、無微生物污染(如細菌、真菌、支原體、病毒等)、無其他對細胞產生損傷作用的生物活性物質污染(如抗體、補體)。對于天然培養基,污染主要來源于取材過程及生物材料本身,應當嚴格選材,嚴格操作。對于合成培養基,污染主要來源于配制過程,配制所用的水,器皿應十分潔凈,配制后應嚴格過濾除菌。
        第三節天然細胞培養基
        天然培養基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養基,如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養技術建立早期,體外培養細胞都是利用天然培養基。但是由于天然培養基制作過程復雜、批間差異大,因此逐漸為合成培養基所替代。目前廣泛使用的天然培養基是血清,另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質在培養某些特殊細胞也是必不可少。
        一、血清(serum)細胞培養的發展,培養基的質量又是關鍵,而培養基的主要成份中動物血清對細胞的生長繁殖發揮著重要甚至是難以替代的作用。在動物血清的應用中牛血清又是最為廣泛的,所以血清是醫藥生物技術產品中重要的原材料之一。保證血清質量也是促進生物制品質量提高的重要環節。
        1.血清種類:目前用于組織培養的血清主要是牛血清,培養某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養細胞的原因:來源充足、制備技術成熟、經過長時間的應用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清對絕大多數哺乳動物細胞都是適合的,但并不排除在培養某種細胞時使用其他動物血清更合適。
        牛血清是細胞培養中用量最大的天然培養基,含有豐富的細胞生長必須的營養成份,具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應取自剖腹產的胎牛;新牛血清取自出生24小時之內的新生牛;小牛血清取自出生1030天的小牛。顯然,胎牛血清是品質最高的,因為胎牛還未接觸外界,血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。
        2.血清的主要成分:血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物,其組成成份雖大部分已知,但還有一部分尚不清楚,且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等,這些物質對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。對血清的成分和作用的研究雖有很大進展,但仍存在一些問題。主要是:
        第一:血清的成份可能有幾百種之多,目前對其準確的成份、含量及其作用機制仍不清楚,尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識,這給研究工作帶來許多困難;
        第二:血清都是批量生產,各批量之間差異很大,而且血清保存期至多一年,因此,要保證每批血清的相似性極為困難,從而使實驗的標準化和連續性受到限制;
        第三:不能排除血清中含有易變物質,這被認為是瓶中惡化的原因之一。
        3.血清主要作用:
        提供基本營養物質:氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等,是細胞生長必須的物質。
        提供激素和各種生長因子:胰島素、腎上腺皮質激素(氫化可的松、地塞米松)、類固醇激素(雌二醇、睪酮、孕酮)等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。
        提供結合蛋白:結合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質,如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等,轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。
        提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。
        對培養中的細胞起到某些保護作用:有一些細胞,如內皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用。這種作用是偶然發現的,現在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度,可以保護細胞免受機械損傷,特別是在懸浮培養攪拌時,粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子,他們在代謝解毒中起重要作用,如SeO3,硒等。
        4.細胞培養中使用血清的缺點
        血清成分復雜,雖含許多對細胞有利成分,也含有對細胞有害的成分,使血清有幾個明顯的缺點:
        對大多數細胞,在體內狀態,血清不是它們接觸的生理學液體,只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清,因此使用血清有可能改變某種細胞在體內的正常狀態,血清可能促進某些細胞的生長(成纖維細胞)同時抑制另一類細胞生長(表皮細胞)。
        血清含一些對細胞產生毒性的物質,如多胺氧化酶,能與來自高度繁殖細胞的多胺反應(如精胺、亞精胺)形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長,甚至造成細胞死亡。
        動物個體不同,血清產地、批號不同,每批質量差異甚大,其成分不能保持一致。
        取材中可能帶入支原體、病毒,對細胞產生潛在影響,可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠性。
        血清的使用使得實驗和生產的標準化困難,其中的蛋白質使得某些轉基因蛋白生物藥品生產中分離純化工作很難完成。
        大規模生產中,血清來源越來越困難,價格昂貴,是構成動物細胞培養對生產成本的主要部分之一。
        5.血清的質量標準:血清質量高低取決于兩方面因素:一是取材對象,二是取材過程。用于取材的動物應健康無病并且在指定的出生天數之內,取材過程應嚴格按照操作規程執行,制備出的血清要經過嚴格的質量鑒定。WHO公布的《用動物細胞體外培養生產生物制品規程》中的要求:
        牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應具備適當的監測系統。
        有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。
        證明所用牛血清中不含對所生產疫苗病毒的抑制物。
        血清要通過濾膜過濾除菌,保證無菌。
        無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染,有些國家要求無細菌噬菌體污染。
        對細胞有良好的支持繁殖作用。
        我國在對牛血清的質量2000年版《中國生物制品主要原輔料質控標準》中提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質含量,細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內毒素,支持細胞增殖檢查。
        血清質量的鑒定一般包括以下幾個方面:
        理化性質:如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量(不低于35-45g/L)、球蛋白含量(應小于20g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項非常重要的指標,血清中球蛋白主要是抗體,球蛋白含量越低血清質量越高。血紅蛋白也是越低越好。
        微生物檢測:包括細菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測,支原體是一種很小的微生物,可通過孔徑22u的濾膜。支原體、病毒污染在光學顯微鏡下難于察覺,細胞也能生長繁殖,但會影響實驗結果。檢測支原體的方法很多,如培養法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。
        促生長效果:這是血清重要的特性之一,應當以培養的細胞來檢測。有兩種方法:克隆形成率、貼瓶率測定法和連續傳代培養法。
        (1)克隆形成率測定:一般以懸浮生長的細胞為培養對象,按有限稀釋法做克隆化培養,將不同批號的血清配制成不同濃度的培養基,細胞也稀釋成不同濃度,接種到96孔板,每孔200ul,培養一定時間,統計有克隆生長的孔,計算出百分比,再與對照的標準血清相比較,就可看出不同批號血清間的區別。比較低的濃度,更能觀察出血清質量間的細微差別。
        (2)貼瓶率測定:是以貼壁細胞為培養對象,將細胞稀釋至低密度,接種至平皿,每皿200100個細胞,以不同濃度的血清培養基培養,培養一定時間后棄培養基,染色后統計集落數,計算出集落數占接種細胞數的百分比,同樣再與標準血清比較,判斷血清質量高低。
        (3)連續傳代培養法:是將細胞培養于3個一定體積的培養瓶中,待測血清配制為5%濃度,一般于第七天收集細胞,計數,取平均值,中間可以更換一次培養基。連續測試三個周期以上,觀察細胞生長狀況,并將每次的計數結果與標準血清的測試結果比較。
        對于使用者,判斷血清質量先從外觀入手。好的血清應該是透明清亮,土黃色或棕黃色,無沉淀或極少沉淀,比較粘稠。如發現血清渾濁、不透明、含許多沉淀物,說明血清污染或血清中的蛋白質變性;若血清呈棕紅色,說明血清中的血紅蛋白含量太高,取材時有溶血現象;如果搖晃時感覺液體稀薄,說明血清中摻入的生理鹽水太多。如果要進一步了解血清的質量,則應連續培養某些細胞,觀察細胞生長狀況。
        6.血清的使用與儲存:正確的使用及保存血清,才能使血清發揮應有的作用。
        使用前處理:大部分血清在使用前必須滅活處理,即56℃30分鐘。滅活的目的是去除血清中的補體成分,避免補體對細胞產生毒性作用。血清經過滅活也會損失一些對細胞有利的成分,如生長因子,因此也有人提出血清不經滅活直接用于培養,這樣做的前提是確認血清中不含補體成分。對于一些品質高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經滅活直接用于細胞培養。
        儲存條件:血清一般儲存于-20℃,同時應避免反復凍融。購買大包裝的血清后,首先要滅活處理,然后分裝成小包裝,儲存于-20℃,使用前融化。融化時最好現置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長時間存放,應盡快使用。
        使用濃度:自從有了合成培養基,血清就是作為一種添加成分與合成培養基混合使用,使用濃度一般為520%,最常用是10%。過多血清容易使培養中的細胞發生變化,特別是一些二倍體的無限細胞系,迅速生長之后容易發生惡性轉化。
        采購血清時,最好先從供應商處索取樣品進行試驗,選定一批后就要保留足夠使用6個月至1年的量,直至用另一批經過預先試驗的樣品代替。
        二、胚胎浸出液
        胚胎浸出液(embryonicextract)是早期動物細胞培養中應用的天然培養基,現已很少使用。
        三、水解乳蛋白水解乳蛋白(lactalbuminhydrolysate)為乳白蛋白經蛋白酶和肽酶水解的產物,含有豐富的氨基酸,是常用的天然培養基,可用于許多細胞和原代細胞的培養。
        第四節合成細胞培養基
        合成培養基是根據天然培養基的成分,用化學物質模擬合成、人工設計、配制的培養基。它有一定的配方,是一種理想的培養基。目前合成培養基多達10多余種,有的培養基仍在不斷進行改良。早期組織培養是利用天然培養基,目前合成培養基已經成為一種標準化的商品,從最初的基本培養基發展到無血清培養基、無蛋白培養基,并且還在不斷發展。合成培養基的出現極大的促進了組織培養技術的普及發展。
        一、基本組分基本培養基包括四大類物質:無機鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。
        無機鹽:CaCl2KClMgSO4NaClNaHCO3NaH2PO4。對調節細胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。
        氨基酸:纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L)。它們都是細胞用以合成蛋白質的必需原料,不能由其他氨基酸或糖類轉化合成。除此之外,還需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用,對細胞的培養特別重要,能促進各種氨基酸進入細胞膜;它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來源,還是合成磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質,谷氨酰胺缺乏可導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養液中都應補加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是:谷氨酰胺在溶液中很不穩定,故4℃下放置1周可分解50%,使用中最好單獨配制,置-20℃冰箱中保存,用前加入培養液中。
        維生素:是維持細胞生長的一種生物活性物質,在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶,對細胞代謝有重大影響。脂溶性維生素(A、D、E、K)常從血清中得到補充。水溶性維生素包括牛物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。維生素C也是不可缺少的,對具有合成膠原能力的細胞更為重要。
        碳水化合物:是細胞生命的能量來源,有的是合成蛋白質和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。體外培養動物細胞時,幾乎所有培養基或培養液中都以葡萄糖作為必含的能源物質。
        葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用:乳酸是葡萄糖不完全氧化的產物。研究表明,體外培養條件下95%的葡萄糖轉變為乳酸,這降低了營養物質的代謝效率,降低培養基pH值,增加滲透壓。在氧氣供給不足的情況下,NADH轉運系統蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統活性低而不能將糖酵解產生的NADH氧化磷酸化為NAD+,細胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脫氫酶將糖酵解產生的丙酮酸與NADH反應生產乳酸和NAD+,從而保證了糖酵解的順利進行。另一個可能的解釋是連接糖酵解與TCA循環的特異性酶如丙酮酸脫氫酶復合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下,直接導致糖酵解與TCA循環的失衡。因此體外培養條件下,葡萄糖主要經糖酵解降解,產生過量的乳酸。減少乳酸生產最常用的方法是限制培養基中葡萄糖的含量,但葡萄糖含量過低可造成細胞營養供應不足,細胞生長抑制。該方法需要對葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產速率以及目的蛋白的表達量等參數進行綜合考慮方可應用。
        在目前常用的培養基中,葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養動物細胞的主要能源,其能量代謝通路與體內完全不同,表現為葡萄糖主要經糖酵解途徑為細胞提供能量,谷胺酰胺大部分通過不完全氧化途徑,另一小部分通過完全氧化為細胞供能。因此,適當的調整細胞內的代謝途徑,使之能促進細胞的快速生長和產物合成,同時減少代謝抑制物的生成是行之有效的一種策略。
        許多動物細胞如CHO、BHK和雜交瘤細胞對營養物質葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而對于細胞生長而言,二者的快速利用并非細胞必需;相反相當一部分轉化為代謝廢物乳酸和氨,以及一些非必需氨基酸如丙氨酸,脯氨酸。其中,乳酸和氨是兩種主要代謝廢物,其積累可影響細胞生長以及產品質量。減少這兩種代謝產物的積累,是大規模細胞培養技術研究的重要方向。
        氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺產生的。限制培養基中谷氨酰胺的含量亦是減少氨生成的常用方法。
        除了以上與細胞生長有關的物質以外,培養基中一般還要加入酚紅(當溶液酸性時pH小于6.8呈黃色;當溶液堿性時pH大于8.4呈紅色),一種pH指示劑。
        在較為復雜的培養液中還包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶兩類)以及氧化還原劑(如谷胱甘肽)等。有的培養液還直接采用了三磷酸腺苷和輔酶A。
        二、常用細胞培養基
        (1).MEM細胞培養基系列(參看本網站-產品展示)
        (2).DMEM細胞培養基系列(參看本網站-產品展示)
        (3)RPMI-1640細胞培養基系列(參看本網站-產品展示)
        (4).199細胞培養基系列(參看本網站-產品展示)
        (5).水解乳蛋白細胞培養基(參看本網站-產品展示)
        (6)歐氏平衡鹽(參看本網站-產品展示)
        (7)F-10,F-12細胞培養基系列(參看本網站-產品展示)
        (8)其它類型細胞培養基
        三、干粉培養基的配制
        配制培養基要注意以下問題:
        認真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分,常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的,如NaHCO3、谷氨酰胺,有些根據實驗需要決定。
        配制是要保證充分溶解,NaHCO3、谷氨酰胺等物質都要等培養基完全溶解之后才能添加。
        配制所用的水應是三蒸水,離子濃度很低。
        所用器皿應嚴格消毒。
        配制好的培養基應馬上過濾,無菌保存于4度。
        液體培養基主要是為了科研工作的方便而設計的培養基,它是一種滅菌后保證無菌的溶液,必要時可制成無內毒素等的溶液,可節省科研人員的工作量。
        配制方法
        在一個盡可能接近總體積的容器中加入比預期培養基總體積少5%的雙蒸水。
        在室溫(20℃30℃)的水中加入干粉培養基,輕輕攪拌,不要加熱。
        水洗包裝袋的內部,轉移全部的痕量干粉到容器內。
        NaHCO3到培養基中。
        用雙蒸水稀釋到想要的體積,攪拌溶解。注意不要過分攪拌。
        通過緩慢攪拌加入1NNaOH1NHCL調節pH值,由于pH值在過濾時會上升0.10.3,因而調節pH值使它比最終想要的pH值低0.20.3。培養基在過濾前要保持密封。
        第五節無血清技術及其培養基
        經歷了天然培養基、合成培養基后,無血清培養基和無血清培養成為當今細胞培養領域的一大趨勢。采用無血清培養可降低生產成本,簡化分離純化步驟,避免病毒污染造成的危害。
        無血清培養基(serumfreemedium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎培養基加少量血清所配制的完全培養基可以滿足大部分細胞培養的要求,但對有些實驗卻不適合,如觀察一種生長因子對某種細胞的作用,這時需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子;又如需要測定某種細胞在培養過程中分泌某種物質(抗體、生長因子)的能力;或者要大規模的培養某種細胞,以獲得它們的分泌產物。因此研制出無血清培養基一直是生物科學工作者努力的目標。上海恒利安生物科技有限公司已成功開發了商業化的多種無血清培養基,可滿足眾多廠商的需求。
        一、無血清培養基的基本配方:基本成分為基礎培養基及添加組分兩大部分。
        用于生物制藥和疫苗生產的細胞在體外培養時,多數呈貼壁生長或兼性貼壁生長;而當其在無血清、無蛋白培養基中生長時,由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白,細胞往往以懸浮形式生長。
        添加組分包括以下幾大類物質:
        (1)促貼壁物質:許多細胞必須貼壁才能生長,這種情況下無血清培養基中一定要添加促貼壁和擴展因子,一般為細胞外基質,如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子,對許多細胞的繁殖和分化,起著重要作用。纖連蛋白主要促進來自中胚層細胞的貼壁與分化,這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質細胞、CHO細胞、成肌細胞等。
        (2)促生長因子及激素:針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質,有些激素是許多細胞必不可少的,如胰島素。
        (3)酶抑制劑:培養貼壁生長的細胞,需要用胰酶消化傳代,在無血清培養基中必不可少須含酶抑制劑,以終止酶的消化作用,達到保護細胞的目的。最常用的是大豆胰酶;抑制劑。
        (4)結合蛋白和轉運蛋白:常見如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大,可增加培養基的粘度,保護細胞免受機械損傷。許多旋轉式培養的無血清培養基都含有牛血清白蛋白。
        (5)微量元素:硒是最常見的。
        二、使用方法:目前,血清仍是動物細胞培養中最基本的的添加物,尤其是在原代培養或者細胞生長狀況不良時,常常會先使用有血清的培養液進行培養,待細胞生長旺盛以后,再換成無血清培養液。細胞轉入無血清培養基培養要有一個適應過程,一般要逐步降低血清濃度,從10%減少到5%,3%,1%,直至無血清培養。在降低過程中要注意觀察細胞形態是否發生變化,是否有部分細胞死亡,存活細胞是否還保持原有的功能和生物學特性等。在實驗后這些細胞一般不再繼續保留,很少有細胞能夠長期培養于無血清培養基而不發生改變的。細胞轉入無血清培養之前,要留有種子細胞,種子細胞按常規培養于含血清的培養基中,以保證細胞的特性不發生變化。
        為了使細胞適應無血清培養,關鍵的是使所培養細胞:
        處于對數生長中期
        ●>90%活細胞率
        適應時以較高的起始細胞接種
        有兩種方法使細胞適應無血清培養基(SFM:
        1.直接適應——細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基(SFM)中。
        一些類型細胞可直接從包含血清的培養基適應無血清培養基。對于直接適應,接種細胞密度應該:2.5×105~3.5×105細胞/ml。當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml時,傳代培養細胞。當細胞密度在培養47天后達到2×106~4×106細胞/ml時,細胞完全適應了無血清培養基。每隔3~5天,當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml,細胞活率在90%時,貯備的適應了無血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。
        2.連續適應——分好幾步把細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基(SFM)中,與直接適應相比較,連續適應趨向對于細胞更加溫和一些。
        2倍正常接種密度接種生長活躍的細胞培養物到75%有血清培養基:25SFM混合培養基中,傳代培養。
        當細胞密度>5×105細胞/ml時,以2×1053×105細胞/ml細胞密度,在有血清培養基:SFM50∶50的混合培養基中傳代培養。
        2×1063×106細胞/ml細胞密度,25%有血清培養基和75%SFM中傳代培養。
        當細胞密度達到1×1063×106細胞/ml(接種后46天),在100SFM培養基中傳代培養。
        每隔35天,當細胞密度達到1×1063×106細胞/ml,細胞活率在90%時,貯備的適應了無血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。
        建議備份前一次混合培養的培養物,直到每一次細胞適應了新的混合培養基。每一次減少血清前,可能需要在SFM/有血清混合培養基中進行幾次傳代。
        在適應過程中,最好不要讓細胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意,與有血清培養基相比,大部分SFM包含非常少的蛋白質,因而更易于受外界因素的影響。
        細胞培養適應替代血清:許多細胞利用連續適應方法能很好的適應,用包含FBS的的培養基和包含有替代血清的培養基1∶1v∶v)的混合培養基培養細胞。通過下列的混合培養基的方式,連續幾代減少當前培養基的量:1∶2,1∶4,1∶16100%替代培養基。每次適應改變血清比例時,傳代細胞23次。
        培養可以直接從FBS轉換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清,生長的延遲可能會發生,4允許進行23次的傳代,使生長率恢復到以前的水平。
        特別需要強調的是:配制無血清培養液必須使用高質量的水,如石英玻璃蒸餾器經三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無血清培養基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子,既便水中的有毒物質含量甚微,也可能對細胞產生致死性損害。這是無血清培養能否成功的關鍵因素之一。
        三、使用無血清培養基的優點
        增加確定性
        性能更加一致
        容易進行純化和下游加工
        細胞功能的精確評估
        增強生長和/或產量
        生理反應性的較好對照
        增強細胞內中介物的檢測
        第六節無蛋白培養基與限定化學成分培養基
        一、無蛋白培養基(proteinfreemidium,PFM:即不含有動物蛋白的培養基。無血清培養基仍含有較多的動物蛋白,如胰島素,轉鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術發展的趨勢來看,不含動物蛋白的培養基又廣泛的應用前景,許多利用基因工程技術重組的蛋白質最終要應用于人體,如果再生長過程中使用了含有動物蛋白質的培養基,純化過程就比較復雜,最終要達到一定的質量標準也有一定的難度。無蛋白培養基就是為了適應這發展趨勢而出現的,許多無蛋白培養基添加了植物水解物以替代動物激素、生長因子的作用。市場上已有適合多種細胞生長的無蛋白培養基。
        二、限定化學成分培養基(chemicaldefinedmedium,CDM):是指培養基中的素有成分都是明確的,它同樣不含有動物蛋白,同樣也不是添加了植物水解物,而是使用了一些已知結構與功能的小分子化合物,如短肽、植物激素等。這種培養基更有利于分析細胞的分泌產物。目前已經有適合于293細胞、CHO細胞、雜交瘤細胞生長的CDM問世,上海恒利安生物科技有限公司生產的水解乳蛋白培養基就屬于CDM。
        第七節其他細胞培養用液
        在細胞培養過程中,除了培養基外,還經常用到一些平衡鹽溶液、消化液、pH調整液等。
        一、平衡鹽溶液(balancedsaltsolution,BSS:主要是由無機鹽、葡萄糖組成,它的作用是維持細胞滲透壓平衡,保持pH穩定及提供簡單的營養。主要用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。最簡單的BSSRinger。D-Hank&apos;sHank&apos;s的一個主要區別是前者不含有Ca2+、Mg2+,因此D-Hank&apos;s常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO2的培養條件,Hank&apos;s平衡液僅含有0.35g/LNaHCO3,不能用于5%CO2的環境,若放入CO2培養相,溶液將迅速變酸,使用時應注意。
        配制溶液應使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+,應當首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。
        二、消化液:取材進行原代培養時常常需要將組織塊消化解離形成細胞懸液,傳代培養時也需要將貼壁細胞從瓶壁上消化下來,常用的消化液有胰酶(Trypsin)溶液和EDTA溶液,有時也用膠原酶(collagenase)溶液。
        1.胰酶溶液:胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示,常見有11251250,即一份胰酶可消化125250份酪蛋白。組織培養用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度,配制時要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液(如前面的D-Hank&apos;s),因為這些物質會對胰酶產生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳pH8-9,配制胰酶溶液應將液體調至pH8左右,充分溶解,過濾除菌。過濾后可以再調只pH7.5,也可不調。
        使用細胞清洗液配制胰酶消化液:含0.5%胰酶的細胞清洗液(100ml細胞清洗液加0.5g胰酶),過濾除菌,分裝于4度保存。
        2.EDTA溶液:EDTA溶液也常用來解離細胞,它的作用機制是破壞細胞間的連接。對于一些貼壁特別牢固的細胞,還可以用EDTA和胰酶的混合液進行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%,配制時應加堿助溶,配制后可過濾除菌,也可高溫消毒滅菌。
        3.膠原酶溶液:膠原酶在上皮類細胞原代培養時經常使用,膠原酶作用的對象是膠原組織,因此不容易對細胞產生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L200000U/L,作用的最佳pH6.5。膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制,配制時可用PBS。
        三、pH調整液:常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。
        1.NaHCO3溶液:NaHCO3是培養基中必須添加的成分,一般情況下按說明書的要求準確添加,以保證培養基在5%CO2的環境下pH達到設計標準。如果是封閉式培養,即不與5%CO2的環境發生交換達到平衡,所使用的培養基就不能按照說明書所要求加入NaHCO3。此時常用5.6%7.4%NaHCO3溶液調節培養基,使之達到所要求的pH環境。
        2.HEPES溶液:是一種弱酸,中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸,對細胞無毒性,主要作用是防止培養基pH迅速變動。在開放式培養條件下,觀察細胞時培養基脫離了5%CO2的環境,CO2氣體迅速逸出,pH迅速升高,若加了HEPES,此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養時要添加HEPES。
        四、抗生素:常用的是青鏈霉素,俗稱雙抗溶液。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效,鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預防絕大多數細菌污染。通常使用青霉素終濃度0.007-0.008g/100ml,鏈霉素終濃度0.01g/100ml。一般配制成100倍濃縮液,可用PBS或培養基配制。
        五、谷氨酰胺補充液:谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重要作用,合成培養基中都要添加,由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定容易降解,4℃下放置7天即可分解約50%,所以都是在使用前添加。配制好的培養液(含谷氨酰胺)在4℃放置2周以上時,要重新加入原來量的谷氨酰胺,故需單獨配制谷氨酰胺,以便臨時加入培養液內。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液,即濃度為200mmol/L29.22g/L),配制時應加溫30℃,完全溶解后過濾除菌,分裝至小瓶,儲存于-20℃。使用時,在每100ml培養液中加入0.5~2ml谷氨酰胺濃縮液,終濃度為1~4mmol/L。
        六、二肽谷氨酰胺(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)
        在細胞培養液中L-谷氨酰胺是大部分細胞培養基的基本成分;而L-谷氨酰胺是一種并不穩定的氨基酸,在中性的水溶液中會自發降解;需要頻繁地補加L-谷氨酰胺。因而在培養操作過程中經常:
        1)頻繁打開蓋子,增加了破壞無菌狀態的可能性;
        2)過多的追加L-谷氨酰胺,增加了培養基中氨的毒性水平。
        二肽谷氨酰胺在細胞培養中穩定而不降解,可高壓滅菌,釋放毒性氨最少!
        二肽谷氨酰胺在細胞內被氨肽酶(E.C.3.4.11.2)所水解,產生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸;因此在大部分細胞系統中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同樣有效地被利用。二肽谷氨酰胺是最優替代物,它無需適應;既可用于貼壁細胞培養,也適合于懸浮細胞的培養。
        第三章細胞培養的基本方法
        第一節培養細胞的細胞生物學
        一、基本概念通常,體外培養的生物成分無外乎兩種結構形式:
        其一是小塊組織或稱為組織塊(tissueblock),一般稱為外植塊;
        其二是將生物組織分散后制成的單個細胞,一般稱為分離的細胞(isolatedcell)或者分散的細胞(dissociatedcell)。
        分散的過程通常在培養液或平衡鹽溶液中進行,分散的細胞被懸浮于培養液或平衡鹽溶液中。
        單個細胞分散存在于培養液或其它平衡鹽溶液中、緩沖溶液中,就稱為細胞懸液(cellsuspension)。
        狹義的細胞培養(cellculture)主要是指分離(散)細胞培養,廣義的細胞培養的概念還包括單(個)細胞培養(singlecellculture)。一種是群體培養(massculture),將含有一定數量細胞的懸液置于培養瓶中,讓細胞貼壁生長,匯合(confluence)后形成均勻的單細胞層;另一種是克隆培養(clonalculture),將高度稀釋的游離細胞懸液加入培養瓶中,各個細胞貼壁后,彼此距離較遠,經過生長增殖每一個細胞形成一個細胞集落,稱為克?。?/span>clone)。一個細胞克隆中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞。
        現今,用于疫苗生產的細胞基本有3類,即原代細胞、二倍體細胞株及傳代細胞系。經過幾十年的研究和發展,目前我國已經擁有了可以進行大規模疫苗生產的動物原代細胞、二倍體細胞和Vero細胞等生產技術,用于生產多種人用、動物疫苗。其中二倍體細胞(如我國70年代建立的人胚肺二倍體細胞株KMB172BS)對多種病毒具有廣泛的敏感性,用其制備病毒性疫苗可以克服使用原代細胞時在其培養物中可能存在的各種潛在致病因子的危險,是當前病毒性疫苗生產較為理想的細胞基質。Vero細胞是1962年由日本Chiba大學的Yasumura等人從成年非洲綠猴腎中分離獲得的,是一種貼壁依賴性成纖維細胞,核型為2n60,高倍體率約為1.7%,可持續地進行培養,不含任何污染因子。通常使用199培養基添加5%胎牛血清進行培養。該細胞可用于多種病毒的增殖,已被WHO批準廣泛用于人用、動物用疫苗生產。
        二、體外培養細胞的分型
        (一)貼附型:大多數培養細胞貼附生長,屬于貼壁依賴性細胞,大致分成以下四型:
        1、成纖維細胞型:胞體呈梭型或不規則三角形,中央有卵圓形核,胞質突起,生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外,凡由中胚層間充質起源的組織,如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內皮等常呈本型狀態。培養中細胞的形態與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。
        2、上皮型細胞:細胞呈扁平不規則多角形,中央有圓形核,細胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動,處于膜邊緣的細胞總與膜相連,很少單獨行動。起源于內、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態。
        3、游走細胞型:呈散在生長,一般不連成片,胞質常突起,呈活躍游走或變形運動,方向不規則。此型細胞不穩定,有時難以和其他細胞相區別。
        4、多型細胞型:有一些細胞,如神經細胞難以確定其規律和穩定的形態,可統歸于此類。
        (二)懸浮型:見于少數特殊的細胞,如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形,不貼于支持物上,呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。
        三、培養細胞的生長和增殖過程:體內細胞生長在動態平衡環境中,而組織培養細胞的生存環境是培養瓶、皿或其它容器,生存空間和營養是有限的。當細胞增殖達到一定密度后,則需要分離出一部分細胞和更新營養液,否則將影響細胞的繼續生存,這一過程叫傳代(PassageSubculture)。每次傳代以后,細胞的生長和增殖過程都會受一定的影響。另外,很多細胞在體外的生存也不是無限的,存在著一個發展過程。所有這一切,使組織細胞在培養中有著一系列與體內不同的生存特點。
        (一)培養細胞生命期(LifeSpanofCultureCells:所謂培養細胞生命期,是指細胞在培養中持續增殖和生長的時間。體內組織細胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。人胚二倍體成纖維細胞培養,在不凍存和反復傳代條件下,可傳3050代,相當于150300個細胞增殖周期,能維待一年左右的生存時間,最后衰老凋亡(Apoptosis)。如供體為成體或衰老個體,則生存時間較短;如培養的為其它細胞,如肝細胞或腎細胞,生存時間更短,僅能傳幾代或十幾代。只有當細胞發生遺傳性改變,如獲永生性或惡性轉化時,細胞的生存期才可能發生改變。正常細胞培養時,不論細胞的種類和供體的年齡如何,在細胞全生存過程中,大致都經歷以下三個階段:
        1.原代培養(PrimaryCulture)期:也稱初代培養,即從體內取出組織接種培養到第一次傳代階段,一般持續14周。此期細胞呈活躍的移動,可見細胞分裂,但不旺盛。初代培養細胞與體內原組織在形態結構和功能活動上相似性大。細胞群是異質的(Heterogeneous),也即各細胞的遺傳性狀互不相同,細胞相互依存性強。
        2.傳代期:初代培養細胞一經傳代后便改稱做細胞系(CellLine)。在全生命期中此期的持續時間最長。在培養條件較好情況下,細胞增殖旺盛,并能維持二倍體核型,呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系(DiploidCellLine)。為保持二倍體細胞性質,細胞應在初代培養期或傳代后早期凍存。當前世界上常用細胞均在不出十代內凍存。如不凍存,則需反復傳代以維持細胞的適宜密度,以利于生存。但這樣就有可能導致細胞失掉二倍體性質或發生轉化。一般情況下當傳代1050次左右,細胞增殖逐漸緩慢,以至完全停止,細胞進入第三期。
        3.衰退期:此期細胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖;細胞形態輪廓增強,最后衰退凋亡。
        在細胞生命期階段,少數情況下,在以上三期任何一點(多發生在傳代末或衰退期),由于某種因素的影響,細胞可能發生自發轉化(SpontaneousTransformation)。轉化的標志之一是細胞可能獲得永生性(Immortality)或惡性性(Malignancy)。細胞永生性也稱不死性,即細胞獲持久性增殖能力,這樣的細胞群體稱無限細胞系(InfiniteCellLine),也稱連續細胞系(ContinuousCellLine)。無限細胞系的形成主要發生在第二期末,或第三期初階段。細胞獲不死性后,核型大多變成異倍體(Heteroploid)。細胞轉化亦可用人工方法誘發,轉化后的細胞也可能具有惡性性質。細胞永生性和惡性性非同一性狀。
        (二)組織培養細胞一代生存期所有體外培養細胞,包括初代培養及各種細胞系,當生長達到一定密度后,都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養液的性質、接種細胞數量和細胞增殖速度等有關。接種細胞數量大、細胞基數大、相同增殖速度條件下,細胞數量增加與飽和速度相對要快(實際上細胞接種數量大時細胞增殖速度比稀少時要快)。連續細胞系和腫瘤細胞系比初代培養細胞增殖快,培養液中血清含量多時細胞增殖比少時快。以上情況都會縮短傳代時間。
        所謂細胞一代一詞,系僅指從細胞接種到分離再培養時的一段時間,這已成為培養工作中的一種習慣說法,它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞,即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代(Generation)或倍增〔Doubling〕不同;在細胞一代中,細胞能倍增36次。
        細胞傳一代后,一般要經過以下三個階段:
        1.潛伏期(LatentPhase):細胞接種培養后,先經過一個在培養液中呈懸浮狀態的懸浮期。此時細胞胞質回縮,胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上,稱貼壁,懸浮期結束。各種細胞貼附速度不同,這與細胞的種類、培養基成分和底物的理化性質等密切相關。初代培養細胞貼附慢,可長達1024小時或更多;連續細胞系和惡性細胞系快,1030分鐘即可貼附。細胞貼附現象是一個非常復雜和與多種因素相關的過程。支持物能影響細胞的貼附;底物表面不潔不利貼附,底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中,有一些特殊物質如纖維連接素(Fibronectin),又稱LETSLargerExternalTransformationSubstance),細胞表面蛋白(CellSurfaceProteinCSP)等也參與貼附過程。這些物質都是蛋白類成分,它們有的存在于細胞膜的表面(如CSP),有的則來自培養基中的血清(LETS)。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質。貼附是貼附類細胞生長增殖條件之一。
        細胞貼附于支持物后,除先經過前述延展過程變成極性細胞,還要經過一個潛伏階段,才進入生長和增殖期。細胞處在潛伏期時,可有運動活動,基本無增殖,少見分裂相。細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類和培養基性質等密切相關。初代培養細胞潛伏期長,約2496小時或更長,連續細胞系和腫瘤細胞潛伏期短,僅624小時;細胞接種密度大時潛伏期短。當細胞分裂相開始出現并逐漸增多時,標志細胞已進入指數增生期。
        2.指數增生期(LogarithmicgrowthPhase):這是細胞增值最旺盛的階段,細胞分裂相增多。指數增生期細胞分裂相數量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。一般以細胞分裂(MitoticIndexMI)表示,即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數。體外培養細胞分裂指數受細胞種類、培養液成分、pH、培養箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數介于0.1%0.5%,初代細胞分裂指數低,連續細胞和腫瘤細胞分裂指數可高達3%5%。pH和培養液血清含量變動對細胞分裂指數有很大影響。指數增生期是細胞一代中活力最好的時期,因此是進行各種實驗最好的和最主要的階段。在接種細胞數量適宜情況下,指數增生期持續35天后,隨細胞數量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后,如培養的是正常細胞,由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動,這種現象稱接觸抑制(ContactInhibition)。而惡性細胞則無接觸抑制現象,因此接觸抑制可作為區別正常與癌細胞標志之一。腫瘤細胞由于無接觸抑制能繼續移動和增殖,導致細胞向三維空間擴展,使細胞發生堆積(Piledup)。細胞接觸匯合成片后,雖發生接觸抑制,只要營養充分,細胞仍然能夠進行增殖分裂,因此細胞數量仍在增多。但當細胞密度進一步增大,培養液中營養成分減少,代謝產物增多時,細胞因營養的枯竭和代謝物的影響,則發生密度抑制(DensityInhibition),導致細胞分裂停止。因此細胞接觸抑制和密度抑制是兩個不同的概念,不應混淆。
        3.停滯期(StagnatePhase):細胞數量達飽和密度后,細胞遂停止增殖,進入停滯期。此時細胞數量不再增加,故也稱平頂期(Plateau)。停滯期細胞雖不增殖,但仍有代謝活動,繼而培養液中營養漸趨耗盡,代謝產物積累、pH降低。此時需做分離培養即傳代,否則細胞會中毒,發生形態改變,重則從底物脫落死亡,故傳代應越早越好。傳代過晚(已有中毒跡象)能影響下一代細胞的機能狀態。在這種情況下,雖進行了傳代,因細胞已受損,需要恢復,至少還要再傳12兩代,通過換液淘汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復后,才能再用。結果反而耽誤了時間,這是在實驗中應特別注意的。
        四、原代培養:即第一次培養,是指將培養物放置在體外生長環境中持續培養,中途不分割培養物的培養過程。有幾方面含義:
        培養物一經接種到培養器皿(瓶)中就不在分割,任其生長繁殖;
        原代培養中的并非細胞的數,因為培養過程中細胞經多次分裂已經產生多代子細胞;
        原代培養過程中不分割培養物不等于不更換培養液,也不等于不更換培養器皿。
        正常細胞培養的世代數有限,只有癌細胞和發生轉化的細胞才能無限生長下去。所謂轉化即是指正常細胞在某種因子的作用下發生突變而具有癌性的細胞。目前世界上許多實驗室所廣泛傳用的HeLa細胞系就是1951年從一位名叫HenriettaLacks的婦女身上取下的宮頸癌細胞培養而成。此細胞系一直延用至今。
        原代培養的細胞一般傳至10代左右就不易傳下去了,細胞的生長就會出現停滯,大部分細胞衰老死亡。但是有極少數的細胞能夠度過危機而繼續傳下去,這些存活的細胞一般能夠傳到4050代,這種傳代細胞叫做細胞株。細胞株的遺傳物質沒有發生改變,在培養過程中其特征始終保持。當細胞株傳至50代以后又會出現危機,不能再傳下去。但是有部分細胞的遺傳物質發生了改變,并且帶有癌變的特點,有可能在培養條件下無限制地傳代下去,這種傳代細胞稱為細胞系。
        原代培養是建立各種細胞系(株)必經的階段,其是否成功與組織污染與否、供體年齡、培養技術和方法、適宜培養基的選擇等多種因素有關。由于原代培養的細胞轉化性極小,對病毒敏感性好,因此適應制備疫苗等生物制品;但也存在有潛在外源因子、不能事先檢查標本、且受供體年齡健康狀況的影響而導致批間差異大等缺陷。目前常用的原代細胞培養有雞胚成纖維細胞及豬腎、猴腎、地鼠腎等原代細胞。
        原代培養的基本過程包括取材、培養材料的制備、接種、加培養液、置培養條件下培養等步驟,在所有的操作過程中,都必須保持培養物及生長環境的無菌。
        多數情況下,分散的細胞若屬于貼壁依賴型細胞,就能黏附、鋪展于培養器皿和載體表面生長而形成細胞單層,這種培養方式稱為單層細胞培養(monolayerculture),又叫貼壁培養(adherentculture)。少數情況下,培養的細胞沒有貼壁依賴性,可通過專門設備使細胞始終處于懸狀態而在體外生長,這種形式稱為懸浮培養(suspensionculture)。如何讓接種的細胞盡快貼壁,是決定培養成功的關鍵步驟:
        取決于適當的生長基質表面;
        可降低接種后培養液對細胞的浮力,如先少補加少量培養液,待細胞貼壁后再補足營養液繼續培養;
        注意適當的細胞接種密度,一般105/ml左右。
        五、傳代培養:當原代培養成功以后,隨著培養時間的延長和細胞不斷分裂,一則細胞之間相互接觸而發生接觸性抑制,生長速度減慢甚至停止;另一方面也會因營養物不足和代謝物積累而不利于生長或發生中毒。此時就需要將培養物分割成小的部分,重新接種到另外的培養器皿(瓶)內,再進行培養。這個過程就稱為傳代(passage)或者再培養(subculture)。對單層培養而言,80%匯合或剛匯合的細胞是較理想的傳代階段。
        體外培養技術中所謂的傳概念并不等于細胞生物學中親代細胞子代細胞的概念。傳代培養的實質就是分割后再一次培養,可以相對地衡量培養物的培養年齡。
        六、生長曲線:細胞接種入培養瓶后,先進入2-24h的延遲期(lagperiod),然后進入指數生長期(即對數期)(logphase),匯合成單層進入緩慢生長或停滯期(即平臺期)(plateaulhase)。每種細胞系(cellline)的這些生長期(growthphase)都是特征性的,只要環境條件保持恒定,每一次測定結果應該是可重復的。
        第二節細胞分離技術
        一、從原代組織中分離細胞將組織塊分離(散)成細胞懸液的方法有多種,最常用的是機械解離細胞法、酶學解離細胞法以及螯合劑解離細胞法。
        從原代組織中獲得單細胞懸液的一般方法是酶解聚。細胞暴露在酶中的時間要盡可能的短,以保持最大的活性。下列步驟可以解聚整個組織,獲得較高產量的有活性細胞。
        1.胰蛋白酶(Trypsin)
        在去除不需要的組織后,使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4mm小片,通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀,去除上清液。重復清洗23次。
        將盛有組織碎片的容器置于冰上,去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶(100mg組織加入1ml胰蛋白酶)。
        4℃孵育618小時,使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進去。
        移棄組織碎片中的胰蛋白酶,在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片2030分鐘。
        在組織碎片加入熱的完全培養基,用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養基,要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。
        通過無菌不銹鋼絲網(100200mm)過濾,分散所有剩余組織。計數和接種細胞,進行培養。
        2.膠原酶(Collagenase)
        用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片,用Hanks&apos;平衡液(HBSS)清洗組織碎片幾次。
        加入膠原酶(50200單位/ml,溶解在HBSS中)。
        37℃孵育418小時。加入3mMCaCl2增加解離效率。
        通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液,以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚,在碎片中加入新鮮的膠原酶。
        通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。
        再一次在培養基中懸浮細胞,計數和接種細胞,進行培養。
        3.Dispase
        用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片,用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。
        加入Dispase0.62.4單位/ml溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液)
        37℃孵育20分鐘到幾個小時。
        通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液,以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚,在碎片中加入新鮮的Dispase。
        通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。
        再一次在培養基中懸浮細胞,計數和接種細胞,進行培養。
        二、從原培養容器中分離細胞:以下是從基層迅速分離細胞,且保持細胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著對于所有細胞系的廣泛應用,每一種系統最佳條件和施用濃度應該根據經驗加以確定。
        再次培養時檢測細胞的活性。
        細胞的活率應該超過90
        對于無血清培養基,降低胰蛋白酶使用量。
        1.移棄使用過的細胞培養基。
        2.使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸.)清洗細胞(看表確定正確的清洗溶液)。在培養瓶對著細胞的一面加入清洗溶液,通過轉動培養瓶12分鐘清洗細胞層,然后去除清洗液。
        3.23ml/25cm2的量,加選擇的分離液(見表)到培養瓶對著細胞的一面。確保分離液覆蓋細胞層。在37℃孵育培養瓶,輕輕搖動培養瓶。通常,在515分鐘內,細胞就會脫落。細胞分離需要的時間因細胞系不同而有所變化。仔細監測細胞分離過程,避免細胞受損傷。對難于從培養瓶基層分離的細胞系,可以輕輕敲打,以加速分離過程。
        4.當細胞完全分離時,垂直放置培養瓶,讓細胞流到培養瓶的底部。在培養瓶中加入完全培養基,通過移液管在單層細胞表面反復吹打來分散細胞。計數并再次培養細胞。
        5.對于無血清培養基,加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1v∶v0.25mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。
        第三節細胞的凍存與復蘇
        為了防止因污染或技術原因使長期培養功虧一簣,考慮到培養細胞因傳代而遲早會出現變異,有時因寄贈、交換和購買,培養細胞從一個實驗室轉運到另一個實驗室,最佳的策略是進行低溫保存。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要?,F簡要介紹深低溫保存法(70℃~196℃)的特點。細胞深低溫保存的基本原理是:在-70℃以下時,細胞內的酶活性均己停止,即代謝處于完全停止狀態,故可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵,在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內,水晶呈針狀,極易招致細胞的嚴重損傷。
        一、細胞的凍存:為避免污染造成的損失,最小化連續細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉化,需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前,細胞應該特性化并檢查是否污染。
        有幾種普通培養基用來凍存細胞。對于包含有血清的培養基,成分可能如下:
        包含10%甘油的完全培養基,
        包含10%二甲基亞砜(DMSO)的完全培養基,
        ◆50%細胞條件培養基和50%含有10%甘油的新鮮培養基,或
        ◆50%細胞條件培養基和50%含有10%二甲基亞砜的新鮮培養基。
        對于無血清培養基,一些普通的培養基成分可能是:
        ◆50%細胞條件無血清培養基和50%包含有7.5%二甲基亞砜的新鮮的無血清培養基,或
        包含有7.5%二甲基亞砜和10%細胞培養級BSA的新鮮無血清培養基。
        1.懸浮細胞
        計數將要凍存的活細胞。細胞應該處于對數生長期。以大約200400g離心5分鐘沉淀細胞,使用移液管移去上清到最小體積,不要攪亂細胞。
        1×1075×107細胞/ml密度,在包含有血清的冷凍培養基中再次懸浮細胞,或者以0.5×1071×107在無血清培養基中,再次懸浮細胞。
        分裝進凍存管,將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中,5分鐘內開始冷凍步驟。
        細胞以1℃/分鐘進行冷凍,可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃-90℃的冰箱中,然后轉移到液氮中貯存。
        2.貼壁細胞
        使用分離試劑從基層分離細胞,分離時盡可能溫和,使對細胞的損傷減少到最小。
        在完全生長培養基中,再次懸浮分離細胞,確定有活力細胞數。
        以大約200g離心5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到最小體積,不要攪亂細胞。
        5×1061×106細胞/ml密度,在凍存液中懸浮細胞。
        分裝進凍存管,將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中,5分鐘內開始冷凍步驟。
        細胞以1℃/分鐘進行冷凍,可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃-90℃的冰箱中,然后轉移到液氮中貯存。
        二、凍存細胞的復蘇:凍存細胞較脆弱,要輕柔操作。凍存細胞要快速融化,并直接加入完全生長培養基中。若細胞對凍存劑(DMSO或甘油)敏感,離心去除凍存培養基,然后加入完全生長培養基中。
        1.直接鋪板方法
        取出貯存細胞,37℃水浴中快速融化。
        直接用完全生長培養基鋪板細胞。1ml凍存細胞使用10~20ml完全生長培養基。進行活細胞計數,細胞接種應該至少在3×105活細胞/ml。
        培養細胞1224小時,更換新鮮的完全生長培養基,去除凍存劑。
        2.離心方法
        取出貯存細胞,37℃水浴中快速融化。
        12ml凍存細胞加入到大約25ml完全生長培養基,輕輕混勻。
        以大約80xg離心23分鐘。
        棄去上清。
        在完全生長培養基輕輕再次懸浮細胞,并且進行活細胞計數。
        細胞鋪板,細胞接種應該至少為3×105活細胞/ml。
        三、細胞的分化、衰老與死亡
        1.細胞的分化:一個成年人全身細胞總數約1012個,可以區分為200多種不同類型的細胞:形態結構,代謝,行為,功能等各不相同。追根溯源,這么多種細胞均來自一個受精卵細胞。所以,通常把發育過程中,細胞后代在形態、結構和功能上發生差異的過程稱為細胞分化。細胞分化發生在胚胎階段,也發生在胎兒出生以后,乃至成人階段。例如,人體血細胞的產生和分化,這個過程在人的一生中一直持續著。
        由旺盛生長不斷分裂的細胞,轉入分化,通常從細胞周期中G1期開始時一個確定的點G0逃逸出細胞周期。旺盛生長分裂的細胞和各種分化了的細胞,它們的基因表達和代謝活動各不相同。
        2.細胞的衰老:體外細胞培養實驗證明:
        成纖維細胞:來自胎兒傳代50次后衰老死亡,來自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關);來自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來自烏龜傳代90--125次后衰老死亡。
        細胞衰老過程中會發生一系列的變化,包括:蛋白質合成速度降低,已有蛋白質結構變化,特異蛋白質成份出現;同時,細胞核,線粒體,膜系統、骨架系統等都有結構、功能的改變。
        細胞衰老原因,尚無定論,出現過好幾種理論與假說,其中得到較廣泛認可的是自由基損傷假說。
        3.細胞凋亡:細胞的死亡是個體存活的正?,F象,常見的細胞死亡形式有3種:壞死、凋亡和細胞毒性。多細胞生物的生命活動中,因為環境因素的突然變化或病原物的入侵,導致一部分細胞死去,稱為細胞的病理死亡,或細胞壞死。壞死是細胞暴露于嚴重的物理或化學刺激時導致的細胞死亡;細胞毒性是由細胞或者化學物質引起的單純的細胞殺傷事件,不依賴于其它兩種細胞死亡機理,如殺傷T細胞的細胞毒性作用。
        還有一種情況,一部分細胞的死亡是生物個體正常生命活動(代謝、生長、發育、分化)的一個必要部分;似乎帶有犧牲局部,保全整體的意味。這種情況下的細胞死亡,明顯地受遺傳控制,稱為細胞凋亡。凋亡(Apoptosis)則是程序性的、正常的細胞死亡,是機體清除無用的或者不想要的細胞的手段。它與細胞壞死是兩個截然不同的過程,無論從形態學、生物學還是生化的特征來說,都有明顯的區別。細胞凋亡現象普遍存在于生物界。細胞凋亡與細胞增殖、分化和衰老起著互補與平衡的作用,在多細胞動物的發育、形態建成與維持中扮演至關重要的角色。作為細胞的一種基本生命現象,凋亡失控的結果將是可怕的:凋亡不足時,易發生癌變、病毒性疾病和自身免疫疾??;而凋亡過量則可能產生獲得性免疫缺陷綜合征(HIV)、重癥肝炎與退行性神經疾病,如老年性癡呆癥(Alzheimer&apos;sdisease)、帕金森氏癥(Parkinson&apos;sdisease)。因此研究細胞凋亡及其機理具有重要的理論和實踐意義。
        細胞凋亡與壞死的區別
        壞死:
        形態學特征-膜完整性喪失,胞漿和線粒體膨脹,全細胞裂解
        生化特征-離子內環境失調,非能量依賴性的(被動過程,在4°C也可以發生),隨機消化DNA(電泳顯示為DNA彌散狀態),PostlyticDNA斷裂
        生理學特征-影響群組細胞由非生理學因素引起(如補體攻擊、代謝中毒、缺氧等),被巨噬細胞吞噬,周圍有明顯的炎癥反應
        凋亡:
        形態學特征-胞膜出芽,但保持完整,染色體聚集在核膜周邊,胞漿收縮、細胞核凝集,最后細胞分裂為凋亡小體,Bcl-2家族蛋白導致線粒體膜通透性增加
        生化特征--ATP依賴性的(主動過程,在4°C不能發生),以核小體為單位剪切DNA(電泳顯示為DNAladder,PrelyticDNA斷裂,線粒體釋放多種因子至胞漿中(細胞色素c、AIF,Caspases級聯活化,膜對稱性改變(PS外翻)
        生理學特征--只影響單個細胞,由生理學刺激誘導(如生長因子缺乏、激素環境改變等),被臨近細胞和巨噬細胞吞噬無炎癥反應
        第四節細胞計數及活力測定
        一、原理培養的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好,所以要進行細胞計數。計數結果以每毫升細胞數表示。細胞計數的原理和方法與血細胞計數相同。
        在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞,總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力,由組織中分離細胞一般也要檢查活力,以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復蘇后的細胞也要檢查活力,了解凍存和復蘇的效果。
        用臺盼蘭染細胞,死細胞著色,活細胞不著色,從而可以區分死細胞與活細胞。利用細胞內某些酶與特定的試劑發生顯色反應,也可測定細胞相對數和相對活力。
        二、儀器、用品與試劑
        1、儀器與用品:普通顯微鏡、血球計數板、試管、吸管、酶標儀(或分光光度計)
        2、試劑:0.4%臺盼蘭,0.5%四甲基偶氮唑鹽(MTT)、酸化異丙醇
        3、材料:細胞懸液
        三、操作步驟
        (一)細胞計數
        1、將血球計數板及蓋片用擦試干凈,并將蓋片蓋在計數板上。
        2、將細胞懸液吸出少許,滴加在蓋片邊緣,使懸液充滿蓋片和計數板之間。
        3、靜置3分鐘。
        4、鏡下觀察,計算計數板四大格細胞總數,壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算:
        細胞數/ml4大格細胞總數/4×10000
        注意:鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團,應按單個細胞計算,若細胞團占10%以上,說明分散不好,需重新制備細胞懸液。
        (二)細胞活力
        1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中。
        2、加入0.5ml0.4%臺盼蘭染液,染色23分鐘。
        3、吸取少許懸液涂于載玻片上,加上蓋片。
        4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數,計細胞活力。
        死細胞能被臺盼蘭染上色,鏡下可見深蘭色的細胞,活細胞不被染色,鏡下呈無色透明狀。
        活力測定可以和細胞計數合起來進行,但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。
        (三)MTT法測細胞相對數和相對活力
        活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產生蘭色結晶狀甲贊顆粒積于細胞內和細胞周圍。其量與細胞數呈正比,也與細胞活力呈正比。
        l、細胞懸液以1000rpm離心10分鐘,棄上清液。
        2、沉淀加入0.51mlMTT,吹打成懸液。
        3、37℃下保溫2小時。
        4、加入4—5ml酸化異丙醇(定容)。打勻。
        5、1000rpm離心,取上清液酶標儀或分光光度計570nm比色,酸化異丙醇調零點。
        注意:MTT法只能測定細胞相對數和相對活力,不能測定細胞絕對數。
        第五節細胞的分裂指數
        一、原理:體外培養細胞生長、分裂繁殖的能力,可用分裂指數來表示。它與生長曲線有一定的聯系,如隨著分裂指數的不斷提高,細胞也就進入了指數生長期。分裂指數指細胞群體中分裂細胞所占的百分比,它是測定細胞周期的一個重要指標,也是不同實驗研究選擇細胞的重要依據。
        二、儀器、用品與試劑
        1、儀器與用品:CO2培養箱、普通顯微鏡、細胞培養血、蓋玻片、吸管
        2、試劑:培養液、胰酶、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液
        三、操作步驟
        1、消化細胞,將細胞懸液接至內含蓋玻片的培養皿中。
        2、CO2培養箱中培養48小時,使細胞長在蓋片上。
        3、取出蓋片,按下列順序操作:
        PBS漂洗3分鐘甲醇:冰醋酸=31固定液中固定30分鐘→Giemsa液染色10分鐘自來水沖洗。
        4、蓋片晾干后反扣在載玻片上,鏡檢。
        5、計算:
        分裂指數=分裂細胞數/總細胞數×100%
        四、注意事項;操作時動作要輕,以免使蓋片上的細胞脫落。
        第六節細胞周期的測定
        一、原理:細胞周期指細胞一個世代所經歷的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。
        單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法,但它不能代表細胞群體的周期,故現多采用其他方法測群體周期。測定細胞周期的方法很多,有同位素標記法、細胞計數法等,這里介紹一種利用BrdU滲入測定細胞周期的方法。
        BrdU5-溴脫氧尿嘧啶核苷)加入培養基后,可做為細胞DNA復制的原料,經過兩個細胞周期后,細胞中兩條單鏈均含BrdUDNA將占l/2,反映在染色體上應表現為一條單體淺染。如經歷了三個周期,則染色體中約一半為兩條單體均淺染,另一半為一深一淺。細胞如果僅經歷了一個周期,則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例,就可算出細胞周期的值。
        二、儀器、用品與試劑
        1、儀器、用品:同常規細胞培養
        2、試劑:BrdU1.0mg/ml),甲醇、冰醋酸,Giemsa染液,秋水仙素,2×SSC
        三、操作步驟
        1、細胞生長至指數期時,向培養液中加入BrdU,使最終濃度為10μg/ml。
        2、44小時加秋水仙素,使每ml中含0.1μg。
        3、48小時后常規消化細胞至離心管中,注意培養上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。
        4、常規染色體制片(見第三部分:染色體技術)。
        5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上,鋪上2×SSC液,距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
        6、棄去2×SSC液,流水沖洗。
        7、Giemsa液染色10分鐘,流水沖洗,晾干。
        8、鏡檢100個分裂相,計第一、二、三、四細胞期分裂指數。
        9、計算:
        細胞周期(Tc=48/{M1+2M2+3M3+4M4/100}(小時)
        第七節培養物的污染及防止
        按現代的觀念,凡是混入培養環境中對細胞生存產生有害的成分和造成細胞不純的異物都應該視為污染。根據這一概念,組織培養污染物應包括生物(真菌、細菌、病毒和支原體)、化學物質(影響細胞生存、非細胞所需的化學成分)、細胞(非同種的其他細胞)。其中一微生物最為多見。另外,隨著使用細胞種類增多,不同細胞交叉污染,尤其是Hela細胞的污染也時有發生,從而造成細胞不純。
        一、污染途徑污染物,特別是微生物常通過下列途徑進入培養體系,造成污染
        1空氣:空氣是微生物及塵埃顆粒傳播的主要途徑??諝饬鲃有源?,如果培養操作場地于外界隔離不嚴格或消毒不充分,外界不潔空氣很容易進入造成污染。因此,培養設施不能設在通風場所。無菌操作應在凈化臺內進行,工作時要帶口罩,以免因講話、咳嗽等使外界污染進入操作面,造成污染。
        2器材:各種培養器皿、器械消毒不徹底和洗刷不干凈導致污染,另外需要對培養箱進行定期消毒,防止形成污染
        3操作:實驗操作無菌觀念不強,技術不熟練,使用污染的器皿或封瓶不嚴等,都可以造成污染。培養兩種細胞以上時,操作不規范,交叉使用吸管或培養液、瓶等有可能導致細胞交叉污染。
        4血清:有些血清在生產時就已經被支原體或病毒等污染,變成了污染。
        5組織樣本:原代培養的污染多數來源于組織樣本;取材時碘酒消毒后脫碘不徹底,可造成碘混入組織,細胞或培養液中,影響細胞細胞生長。
        二、污染對培養細胞的影響及污染的檢測
        由于體外培養細胞自身沒有抵抗污染的能力,而且培養基中的抗生素抗污染能力有限,因而培養細胞一旦發生污染多數將無法挽回。細胞污染早期或污染程度較輕時,如果能及時去除污染物,部分細胞有可能恢復、但是當污染物持續存在培養環境中,輕者細胞生長緩慢,分類象減少,細胞變得粗糙,輪廓增強細胞漿出現顆粒、污染較嚴重,細胞增值停止,分裂象消失,細胞質中出現大量堆積物,細胞變圓、脫壁。
        (一)細菌污染對培養細胞的影響及污染物的檢測
        常見的污染細菌有大腸桿菌、假單孢菌、葡萄球菌等。細菌污染初期由于培養體系的抗生素作用,其繁殖處于抑制狀態,細胞生長不受明顯影響,污染情況用倒置顯微鏡觀察不易判斷。懷疑培養細胞有細菌污染時,取10ml細胞懸液離心10005分鐘,沉淀中加入無抗生素培養液2ml,將細胞放培養箱培養。
        如果培養無真的細菌污染,24小時內可以獲得陽性結果。當污染的細菌量比較大或者細菌增殖到一定基數時,大約每20分鐘一代,會使培養系統中很快產生大量細菌,后者不僅可以消耗培養系統中的養分,還能釋放大量代謝產物。幾個小時后,增殖的細菌就可以導致培養液外觀渾濁,肉眼就可以判斷。細菌污染大多數可以改變培養液pH,使培養液變渾濁、變色。用相差顯微鏡觀察,可見滿視野都是點狀的細菌顆粒,原來的清晰培養背景變得模糊,大量的細菌甚至可以覆蓋細胞,對細胞的生存構成威脅。用青霉素、鏈霉素可以預防細菌污染有效。
        (二)真菌污染對細胞的影響及污染物的檢測
        微生物污染中以真菌最多,真菌種類繁多,形態各異,但是污染后易于發現,大多呈白色或淺黃色小點漂浮于培養液表面,肉眼可見;有的散在生長,鏡下可見呈絲狀、管狀、樹枝狀,縱橫交錯穿行于細胞之間。念珠菌和酵母菌卵圓形,散在細胞周邊和細胞之間生長。真菌生長迅速,能在短時間內抑制細胞生長、產生有毒物質殺死細胞??拐婢苿︻A防和排除真菌污染有效。
        (三)支原體污染對細胞影響及污染物的檢測
        細胞培養(特別是傳代細胞)被支原體污染是個世界性問題,是細胞培養最常見的、干擾試驗結果的一種污染。但由于不易被察覺,有些污染的細胞仍在被應用。研究表明,95%以上是以下四種:口腔支原體(M.orale)、精氨酸支原體(M.arginini)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)和萊氏無膽甾原體(A.laidlawii),為牛源性。以上是最常見的污染細胞培養的支原體菌群,但能夠污染細胞的支原體種類是很多的,國外調查證明,大約有二十多種支原體能污染細胞,有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。據查,目前各實驗室使用的二倍體細胞和傳代細胞中約有11%的細胞受到支原體污染。
        污染來源包括工作環境污染、操作者本身污染(一些支原體在人體是正常菌群)、培養基污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。支原體污染后,因為它們不會使細胞死亡可以與細胞長期共存,培養基一般不發生渾濁,細胞無明顯變化,外觀上給人以正常感覺,實則細胞手到多方面潛在影響,如引起細胞變形,影響DNA合成,抑制細胞生長等。
        細胞培養中,主要從以下幾個方面來預防支原體的污染:
        控制環境污染;
        嚴格實驗操作;
        細胞培養基和器材要保證無菌;
        在細胞培養基中加入適量的抗生素。
        支原體污染細胞后,特別是重要的細胞株,有必要清除支原體,常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯合處理。支原體最突出的結構特征是沒有細胞壁,一般來講,對作用于細胞壁生物合成的抗生素,如-內酰胺類、萬古霉素等完全不敏感;對多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環素類、大環內酯類及一些氟喹諾酮;其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用,所以常不用來作為支原體感染的化學治療劑。
        (四)細胞交叉污染對細胞的影響及污染物的檢測
        細胞培養中,細胞間交叉污染并不罕見,多是由于在培養中操作時各種細胞同時進行,混雜使用器皿和液體所致,這種污染能使細胞的生長特性、形態特征等發生變化,有些變化較輕、不易察覺,有些可能由于污染的細胞具有生長優勢最終壓過原來細胞而導致細胞的生長抑制,最終死亡。常用觀察細胞形態學、分析生長特性和核型、檢測細胞的標記物等方法檢測交叉污染的細胞。
        三、污染的預防:防止污染,預防是關鍵,預防措施應該貫穿整個細胞培養的始終。
        1.器皿準備中的預防:用于細胞培養的器皿應該嚴格消毒,做到真正潔凈;應該無菌的物品,要做到消毒嚴格、真正無菌;器皿的運輸、貯存過程中,要嚴格操作,謹防污染。
        2.開始操作前的預防:應當按廠家規定,定期清洗或更換超凈臺的空氣濾網,請專職人員定期檢查超凈臺的空氣凈化標準;檢查培養皿是否有消毒標志,有條件得實驗室可以使用一次性用品;檢查新配置的培養液,確認無菌方可使用;操作前提前半小時啟動超凈臺的紫外燈消毒;操作應戴口罩,消毒雙手。
        3.操作過程中的預防;主要包括:超凈臺內放置的所有培養瓶瓶口不能與風向相逆,不允許用手觸及器皿的無菌部分,如瓶口和瓶塞內側;在安裝吸管冒、開啟或封閉瓶口操作時要經過酒精燈燒灼,并在火焰附件工作;吸取培養液、細胞懸液等液體時,應專管專用,防止污染擴大或造成培養物的交叉污染;使用培養液前,不易較早開啟瓶口;開瓶后的培養瓶應保持斜位,避免直立;不再使用的培養液應立即封口;培養的細胞在處理之前不要過早的暴露空氣中;操作時不要交談、咳嗽,以防唾沫和呼出氣流引發污染;操作完畢后應將工作臺面整理好,并消毒擦拭工作面,關閉超凈臺。
        4.其他預防:及早凍存培養物;重要的細胞株傳代工作應有兩個人獨立進行;購入的未滅活血清應采取56度水浴滅活30分鐘使血清的補體和支原體滅活;為了避免誘導抗藥細菌,應定期更換培養系統的抗生素,或盡可能不用抗生素;對新購入的細胞株應加強觀察,防止外來的污染源;定期消毒培養箱。
        四、污染的排除:培養的細胞一旦污染應及時處理,防止污染其他細胞。通常選高壓滅菌被污染的細胞,然后棄掉。如果有價值的細胞被污染,并且污染程度較輕,可以通過及時排除污染物,挽救細胞恢復正常。常用的排除微生物污染的方法有以下幾種:
        1抗生素排除法:抗生素是細胞培養中殺滅細菌的主要手段。各種抗生素性質不同,對微生物作用也不同,聯合應用比單用效果好,預防性應用比污染后應用好;如果發生微生物污染后再使用抗生素,常難以根除。有的抗生素對細菌僅有抑制作用,無殺滅效應。反復使用抗生素還能使微生物產生耐藥性,而且對細胞本身也有一定影響,因此有人主張盡量不用抗生素處理,當然,一些有價值的細胞被污染后,仍需要用抗生素挽救,在這種情況下,可采用510倍于常用量的沖擊法,加入高濃度抗生素后作用2448小時,再換入常規的培養液,有時可以奏效。
        2加溫除菌:根據支原體耐熱性能差的特點。有人將受支原體污染的細胞置于41度中作用510小時(最長可以達18小時)殺滅支原體。但是41度對細胞本身應有較大影響,故在處理前,應先進行預試驗,確定最大限度殺傷支原體而對細胞影響較小的處理時間。
        3動物體內接種:受微生物污染的腫瘤細胞可以接種到同種動物皮下或腹腔,借動物體內免疫系統消滅掉微生物,腫瘤細胞卻能在體內生長,待一定時間,從體內取出再進行培養繁殖。
        4與巨噬細胞共培養:在良好的體外培養條件下巨噬細胞可以存活710天,并可以分泌一些細胞因子支持其他細胞的科隆生長。與體內情況相似,巨噬細胞在體外條件下仍然可以吞噬微生物并將其消化。利用96孔板將極少培養細胞與巨噬細胞共培養,可以在高度稀釋培養細胞、極大地降低微生物污染程度地同時,更有效地發揮巨噬細胞清除污染地效能。本方法與抗生素聯合應用效果更佳。
        第四章動物細胞大規模培養技術
        第一節大規模培養技術應用簡介
        通過大規模體外培養技術培養哺乳類動物細胞是生產生物制品的有效方法。20世界60-70年代,就已創立了可用于大規模培養動物細胞的微載體培養系統和中空纖維細胞培養技術。近十數年來,由于人類對生長激素、干擾素、單克隆抗體、疫苗及白細胞介素等生物制品的需求猛增,以傳統的生物化學技術從動物組織獲取生物制品已遠遠不能滿足這一需求。隨著細胞培養的原理與方法日臻完善,動物細胞大規模培養技術趨于成熟。
        所謂動物細胞大規模培養技術(large-scaleculturetechnology)是指在人工條件下(設定ph、溫度、溶氧等),在細胞生物反應器(bioreactor)中高密度大量培養動物細胞用于生產生物制品的技術。目前可大規模培養的動物細胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細胞及人二倍體細胞、cho(中華倉鼠卵巢)細胞、BHK-21(倉鼠腎細胞)、Vero細胞(非洲綠猴腎傳代細胞,是貼壁依賴的成纖維細胞)等,并已成功生產了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細胞生成素、單克隆抗體等產品。
        在過去幾十年來,該技術經有了很大發展,從使用轉瓶(rollerbottle)、CellCube等貼壁細胞培養,發展為生物反應器(Bioreactor)進行大規模細胞培養。第一代細胞培養技術核心問題是難以產業化或者說是規?;a:一是在工藝生產時不能大規模制備產品;二是非批量生產容易導致產品質量的不均一性;三是難以對同批生產進行生產和質量控制。
        隨著生物技術的發展,迫切需要大規模的細胞培養,特別是培養表達特異性蛋白的哺乳動物細胞,以便獲得大量有用的細胞表達產物。采用玻璃瓶靜置或旋轉瓶的培養方法,已不能滿足所需細胞數量及其分泌產物。因而必須為工業化生產開創一種新的技術方法。自70年代以來,細胞培養用生物反應器有很大的發展,種類越來越多,規模越來越大,較常見的細胞培養生物反應器有空氣提升反應器,中空纖維管反應器,無泡攪拌反應器及籃式生物反應器等。八十年代以來,人們逐漸開始以生物反應器培養代替鼠腹水的方法獲得單克隆抗體。
        動物細胞是一種無細胞壁的真核細胞,生長緩慢,對培養環境十分敏感。采用傳統的生物化工技術進行動物細胞大量培養,除了要滿足培養過程必需的營養要求外,有必要建立合理的控制模型,進行pH和溶氧(DO)的最佳控制。細胞生物反應器可通過微機有序地定量地控制加入動物細胞培養罐內的空氣、氧氣、氮氣和二氧化碳四種氣體的流量,使其保持最佳的比例來控制細胞培養液中的pH值和溶氧水平,使系統始終處于最佳狀態,以滿足動物細胞的生長對pH值和溶解氧的需要。如為提高或達到一定的溶氧水平可改變通入培養罐內氣體中氧氣和氮氣的比例來實現控制DO值的目的。采用二氧化碳/碳酸氫鈉(CO2/NaHCO3)緩沖液系統來控制培養液的pH值是一種較好的方法。
        現在,由于動物細胞培養技術在規模和可靠性方面都不斷發展,且從中得到的蛋白質也被證明是安全有效的,因此人們對動物細胞培養的態度已經發生了改變。許多人用和獸用的重要蛋白質藥物和疫苗,尤其是那些相對較大、較復雜或糖基化(glycosylated)的蛋白質來說,動物細胞培養是首選的生產方式。60年代初,英國AVRI研究所在貼壁細胞系BHK21中將口蹄疫病毒培養成功后,從最初的200ml800ml玻璃容器開始,很快就放大到30L100L不銹鋼罐的培養規模。使用的是基于Eagle&apos;s配方的培養基,補充5%成年牛血清和蛋白胨。1967年以后,Wellcome(現為Cooper動物保?。┘瘓F分布于歐洲、非洲和南美洲8個國家的生產廠商,應用此項技術工業規?;a口蹄疫疫苗和獸用狂犬疫苗,已掌握了5000L的細胞罐大規模培養技術。
        目前已實現商業化的產品有:口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰瘡病毒疫苗、巨細胞病毒疫苗、αβ干擾素、血纖維蛋白溶酶原激活劑、凝血因子、促紅細胞素、松弛素、生長激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽釋放酶及200種單克隆抗體等。其中,口蹄疫疫苗是動物細胞大規模培養方法生產的主要產品之一。1983年,英國Wellcome公司就已能夠利用動物細胞進行大規模培養生產口蹄疫疫苗。美國Genentech公司應用SV40為載體,將乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳動物細胞內進行高效表達,已生產出乙型肝炎疫苗。英國Wellcome公司采用8000LNamalwa細胞生產α干擾素。英國Celltech公司用氣升式生物反應器生α、βγ干擾素;用無血清培養液在10000L氣升式生物反應器中培養雜交瘤細胞生產單克隆抗體。美國Endotronic公司用中空纖維生物反應器大規模培養動物細胞生產出免疫球蛋白G、A、M和尿激酶、人生長激素等。
        第二節大規模培養常用方法
        根據動物細胞的類型,可采用貼壁培養、懸浮培養和固定化培養等三種培養方法進行大規模培養。
        一、動物細胞生長特性及培養溫度
        1.細胞生長緩慢,易污染,培養需用抗生素
        2.細胞大,無細胞壁,機械強度低,環境適應性差
        3.需氧少,不耐受強力通風與攪拌
        4.群體生長效應,貼壁生長(錨地依賴性)
        5.培養過程產品分布細胞內外,成本高
        6.原代培養細胞一般繁殖50代即退化死亡
        依據在體外培養時對生長基質依賴性差異,動物細胞可分為兩類:
        貼壁依賴型細胞:需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面才能生長,大多數動物細胞,包括非淋巴組織細胞和許多異倍體細胞均屬于這一類。
        非貼壁依賴型細胞:無需附著于固相表面即可生長,包括血液、淋巴組織細胞、許多腫瘤細胞及某些轉化細胞。
        培養細胞的最適溫度相當于各種細胞或組織取材機體的正常溫度。人和哺乳動物細胞培養的最適溫度為35~37℃。偏離這一溫度,細胞正常的代謝和生長將會受到影響,甚至死亡??偟膩碚f,培養細胞對低溫的耐力比高溫高。溫度不超過39℃時,細胞代謝強度與溫度成正比;細胞培養置于39~40℃環境中1h,即受到一定損傷,但仍能恢復;當溫度達43℃以上時,許多細胞將死亡。當溫度下降到30~20℃時,細胞代謝降低,因而與培養基之間物質交換減少。首先看到的是細胞形態學的改變以及細胞從基質上脫落下來。當培養物恢復到初始的培養溫度時,它們原有的形態和代謝也隨之恢復到原有水平。
        二、貼壁培養(attachmentculture)是指細胞貼附在一定的固相表面進行的培養。
        1.生長特性:貼壁依賴型細胞在培養時要貼附于培養(瓶)器皿壁上,細胞一經貼壁就迅速鋪展,然后開始有絲分裂,并很快進入對數生長期。一般數天后就鋪滿培養表面,并形成致密的細胞單層。
        2.貼壁培養的優點:
        容易更換培養液;細胞緊密黏附于固相表面,可直接傾去舊培養液,清洗后直接加入新培養液。
        容易采用灌注培養,從而達到提高細胞密度的目的;因細胞固定表面,不需過濾系統。
        當細胞貼壁于生長基質時,很多細胞將更有效的表達一種產品。
        同一設備可采用不同的培養液/細胞的比例。
        適用于所有類型細胞。
        3.貼壁培養的缺點:與懸浮培養法相比
        擴大培養比較困難,投資大;
        占地面積大;
        不能有效監測細胞的生長;
        4.細胞貼壁的表面:要求具有凈陽電荷和高度表面活性。對微載體而言還要求具一定電荷密度;若為有機物表面,必須具有親水性,并帶陽電荷。
        5.貼壁培養系統:主要有轉瓶、中空纖維(后面專題介紹)、玻璃珠、微載體系統(后面介紹)等。
        轉瓶培養系統:培養貼壁依賴型細胞最初采用轉瓶系統培養。轉瓶培養一般用于小量培養到大規模培養的過渡階段,或作為生物反應器接種細胞準備的一條途徑。細胞接種在旋轉的圓筒形培養器-轉瓶中,培養過程中轉瓶不斷旋轉,使細胞交替接觸培養液和空氣,從而提供較好的傳質和傳熱條件。
        轉瓶培養具有結構簡單,投資少,技術成熟,重復性好,放大只需簡單的增加轉瓶數量等優點。但也有其缺點:勞動強度大,占地空間大,單位體積提供細胞生長的表面積小,細胞生長密度低,培養時監測和控制環境條件受到限制等?,F在使用的轉瓶培養系統包括二氧化碳培養箱和轉瓶機兩類。
        反應器貼壁培養此種培養方式中,細胞貼附于固定的表面生長,不因為攪拌而跟隨培養液一起流動,因此比較容易更換培養液,不需要特殊的分離細胞和培養液的設備,可以采用灌流培養獲得高細胞密度,能有效地獲得一種產品;但擴大規模較難,不能直接監控細胞的生長情況,故多用于制備用量較小、價值高的生物藥品。
        CelliGen、CelliGenPlusTMBioflo3000反應器是常用的貼壁培養式生物反應器,用于細胞貼壁培養時可用籃式攪拌系統和圓盤狀載體。此載體是直徑6毫米無紡聚酯纖維圓片,具很高表面積與體積比(1200cm2/g),利于獲得高細胞密度?;@式攪拌系統和載體培養是目前貼壁細胞培養使用最多方式,用于雜交瘤細胞、Hela細胞、293細胞、CHO細胞及其它細胞培養。此種方式培養細胞,細胞接種后貼壁快。
        三、懸浮培養(suspensionculture):是指細胞在反應器中自由懸浮生長的過程。主要用于非貼壁依賴型細胞培養,如雜交瘤細胞等;是在微生物發酵的基礎上發通起來的。
        無血清懸浮培養是用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細胞培養方式,它能減少后期純化工作,提高產品質量,正逐漸成為動物細胞大規模培養的研究新方向。
        四、固定化培養(immobilizationculture):是將動物細胞與水不溶性載體結合起來,再進行培養。上述兩大類細胞都適用,具有細胞生長密度高,抗剪切力和抗污染能力強等優點,細胞易于產物分開,有利于產物分離純化。制備方法很多,包括吸附法、共價貼附法、離子/共價交聯法、包埋法、微囊法等。
        1.吸附法:用固體吸附劑將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法稱為吸附法(adhesion)。操作操簡便、條件溫和、是動物細胞固定化中最早研究使用的方法。缺點是:載體的負荷能力低,細胞易脫落。微載體培養和中空纖維培養是該方法的代表,稍后專門介紹。
        2.共價貼附法:利用共價鍵將動物細胞與固相載體結合的固定化方法稱為共價貼附法(attachmentbycovalentbonding)。此法可減少細胞的泄漏,但須引入化學試劑,對細胞活性有影響,且因貼附而導致擴散限制小,細胞得不到保護。
        3.離子/共價交聯法:雙功能試劑處理細胞懸浮液,會在細胞間形成橋而絮結產生交交聯作用,此固定化細胞方法稱為離子/共價交聯法(cross-linkingbycovalentbonding)。交聯試劑會使一些細胞死亡,也會產生擴散限制。
        4.包埋法:將細胞包埋在多孔載體內部制成固定化細胞的方法稱為包埋法(entrapment)。優點是:步驟簡便、條件溫和、負荷量大、細胞泄漏少,抗機械剪切。缺點是:擴散限制,并非所有細胞都處于最佳基質濃度,且大分子基質不能滲透到高聚物網絡內部。一般適用于非貼壁依賴型細胞的固定化,常用載體為多孔凝膠,如瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白。
        5.微囊法(microencapsulation:是用一層親水的半透膜將細胞包圍在珠狀的微囊里,細胞不能逸出,但小分子物質及營養物質可自由出入半透膜;囊內是種微小培養環境,與液體培養相似,能保護細胞少受損傷,故細胞生長好、密度高。微囊直徑控制在200-400μm為宜。制備中應注意:
        溫和、快速、不損傷細胞,盡量在液體和生理條件下操作;
        所用試劑和膜材料對細胞無毒害;
        膜的孔徑可控制,必須使營養物和代謝物自由通過;
        膜應有足夠機械強度抵抗培養中攪拌。
        五、抗凋亡策略在細胞大規模培養中的應用
        生物反應器動物細胞大規模生產過程中,細胞凋亡在細胞死亡中占主要部分。最近研究顯示在大規模培養生物反應器中細胞的死亡中80%是凋亡所導致,而不是以前所認為的壞死。而在大規模細胞培養中,細胞死亡是維持細胞高活性和高密度的最大障礙。理論上講,防止或延長細胞死亡,可以極大提高生物反應器生產重組蛋白的產量。
        細胞凋亡由一系列基因精確地調控,是多細胞生物發育和維持穩態所必需的生理現象。已知凋亡的最終執行者是Caspase家族,它們均為半胱氨酸蛋白酶,各識別一個4氨基酸序列,并在識別序列C端天冬氨酸殘基處將底物切斷。Caspase含有可被自身識別的序列,可以切割活化自身而導致信號放大,并作用于下游Caspase成員,從而形成Caspase家族的級聯放大,最終作用于效應蛋白,引起細胞凋亡。
        所以在大規模培養時干擾細胞在培養中凋亡的發生,提高細胞特異性抵制遇到壓力而引起凋亡的能力,有利于提高細胞的培養密度、延長細胞的培養周期,從而提高目標產品的產量2-3倍。
        1.營養物質抗凋亡
        在常規生物反應器構造中,營養耗竭或缺乏培養基中特殊的生長因子則引起凋亡,例如血清,糖或特殊氨基酸的耗盡。培養基中添加氨基酸或其它關鍵營養可抑制凋亡、延長培養時間從而提高產品的生產。大規模培養中細胞凋亡主要由于營養物質的耗竭或代謝產物的堆積引起,如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因,而且凋亡一旦發生,補加谷氨酰胺已不能逆轉凋亡。另外,動物細胞在無血清、無蛋白培養基中進行培養時,細胞變得更為脆弱,更容易發生凋亡。
        2.基因抗凋亡
        與凋亡相關的一系列基因產物可對其進行正、負向的調控,因此可通過導入相應基因來調節細胞凋亡的機制。Bcl-2基因是目前最為有效的抗凋亡基因,在多種細胞系中均表現出很強的抗凋亡活性。
        3.化學方法抗凋亡
        凋亡發生時細胞許多部位發生生化物質的改變,有些變化如改變細胞氧化還原條件產生活性氧在凋亡信號階段發生,其它的如破壞線粒體膜電位、激活caspase則發生在凋亡效應階段,這在絕大多數細胞死亡中是相同的。因此,阻止這些生化物質的改變可能阻止或至少延遲細胞凋亡的發生,運用化學物質可抑制信號效應階段的發生,被認為是抗調亡策略之一。
        第三節大規模培養技術的操作方式
        深層培養可分為:分批式、流加式、半連續式、連續式、連續式和灌注式五種。
        一、分批式培養(batchculture)是細胞規模培養發展進程中較早期采用的方式,也是其它操作方式的基礎。該方式采用機械攪拌式生物反應器,將細胞擴大培養后,一次性轉入生物反應器內進行培養,在培養過程中其體積不變,不添加其它成分,待細胞增長和產物形成積累到適當的時間,一次性收獲細胞、產物、培養基的操作方式。
        該方式的特點:
        操作簡單。培養周期短,染菌和細胞突變的風險小。反應器系統屬于封閉式,培養過程中與外部環境沒有物料交換,除了控制溫度、pH值和通氣外,不進行其他任何控制,因此操作簡單,容易掌握;
        直觀反映細胞生長代謝的過程。因培養期間細胞生長代謝是在一個相對固定的營養環境,不添加任何營養成分,因此可直觀的反映細胞生長代謝的過程,是動物細胞工藝基礎條件或"小試"研究常用的手段;
        可直接放大。由于培養過程工藝簡單,對設備和控制的要求較低,設備的通用性強,反應器參數的放大原理和過程控制,比較其它培養系統較易理解和掌握,在工業化生產中分批式培養操作是傳統的、常用的方法,其工業反應器(Genetech)規??蛇_12000L。
        分批培養過程中,細胞的生長分為五個階段:延滯期、對數生長期、減速期、平穩期和衰退期,見圖1。分批培養的周期時間多在3-5天,細胞生長動力學表現為細胞先經歷對數生長期(48-72h)細胞密度達到最高值后,由于營養物質耗劫或代謝毒副產物的累積細胞生長進入衰退期進而死亡,表現出典型的生長周期。收獲產物通常是在細胞快要死亡前或已經死亡后進行。
        二、流加式培養(feedingculture
        1.流加式培養是在批式培養的基礎上,采用機械攪拌式生物反應器系統,懸浮培養細胞或以懸浮微載體培養貼壁細胞,細胞初始接種的培養基體積一般為終體積的1/21/3,在培養過程中根據細胞對營養物質的不斷消耗和需求,流加濃縮的營養物或培養基,從而使細胞持續生長至較高的密度,目標產品達到較高的水平,整個培養過程沒有流出或回收,通常在細胞進入衰亡期或衰亡期后進行終止回收整個反應體系,分離細胞和細胞碎片,濃縮、純化目標蛋白。
        2.流加培養特點:
        流加培養根據細胞生長速率、營養物消耗和代謝產物抑制情況,流加濃縮的營養培養基。流加的速率與消耗的速率相同,按底物濃度控制相應的流加過程,保證合理的培養環境與較低的代謝產物抑制水平。
        培養過程以低稀釋率流加,細胞在培養系統中停留時間較長,總細胞密度較高,產物濃度較高。
        流加培養過程須掌握細胞生長動力學,能量代謝動力學,研究細胞環境變化時的瞬間行為。流加培養細胞培養基的設計和培養條件與環境優化,是整個培養工藝中的主要內容。
        在工業化生產,懸浮流加培養工藝參數的放大原理和過程控制,比較其它培養系統較易理解和掌握,可采用工藝參數的直接放大。
        流加培養是當前動物細胞培養中占有主流優勢的培養工藝,也是近年來動物細胞大規模培養研究的熱點。流加培養中的關鍵技術是基礎培養基和流加濃縮的營養培養基。通常進行流加的時間多在指數生長后期,細胞在進入衰退期之前,添加高濃度的營養物質??梢蕴砑右淮?,也可添加多次,為了追求更高的細胞密度往往需要添加一次以上,直至細胞密度不再提高;可進行脈沖式添加,也可以降低的速率緩慢進行添加,但為了盡可能的維持相對穩定的營養物質環境,后者采用較多;添加的成分比較多,凡是促細胞生長的物質均可以進行添加。流加的總體原則是維持細胞生長相對穩定的培養環境,營養成分即不過剩而產生大量的代謝副產物造成營養利用效率下降而成為無效的利用;也不缺乏導致細胞生長抑制或死亡。
        3.流加工藝中的營養成分主要分為三大類:
        葡萄糖:葡萄糖是細胞的供能物質和主要的碳源物質,然而當其濃度較高是會產生大量的代謝產物乳酸,因而需要進行其濃度控制,以足夠維持細胞生長而不至于產生大量的副產物的濃度為佳。
        谷氨酰胺:谷氨酰胺是細胞的供能物質和主要的氮源物質,然而當其濃度較高是會產生大量的代謝產物氨,因而也需要進行其濃度控制,以足夠維持細胞生長而不至于產生大量的副產物的濃度為佳;
        大規模培養中細胞凋亡主要由于營養物質的耗竭或代謝產物的堆積引起,如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因,而且凋亡一旦發生,補加谷氨酰胺已不能逆轉凋亡。另外,動物細胞在無血清、無蛋白培養基中進行培養時,細胞變得更為脆弱,更容易發生凋亡。
        氨基酸、維生素及其他:主要包括營養必需氨基酸、營養非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸;此外還包括其他營養成分如膽堿、生長刺激因子。添加的氨基酸形式多為左旋氨基酸,因而多以鹽或前體的形式替代單分子氨基酸,或者添加四肽或短肽的形式。在進行添加時,不溶性氨基酸如胱氨酸、酪氨酸和色氨酸只在中性pH值部分溶解,可采用泥漿的形式進行脈沖式添加;其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕動泵進行緩慢連續流加。
        4.流加式培養分為兩種類型:單一補料分批式培養和反復補料分批式培養。
        單一補料分批式培養是在培養開始時投入一定量的基礎培養液,培養到一定時期,開始連續補加濃縮營養物質,直到培養液體積達到生物反應器的最大操作容積,停止補加,最后將細胞培養液一次全部放出。該操作方式受到反應器操作容積的限制,培養周期只能控制在較短的時間內。
        反復補料分批式培養是在單一補料分批式操作的基礎上,每個一定時間按一定比例放出一部分培養液,是培養液體積始終不超過反應器的最大操作容積,從而在理論上可以延長培養周期,直至培養效率下降,才將培養液全部放出。
        三、半連續式培養(semi-continuousculture
        1.半連續式培養又稱為重復分批式培養或換液培養。采用機械攪拌式生物反應器系統,懸浮培養形式。在細胞增長和產物形成過程中,每間隔一段時間,從中取出部分培養物,再用新的培養液補足到原有體積,使反應器內的總體積不變。
        這種類型的操作是將細胞接種一定體積的培養基,讓其生長至一定的密度,在細胞生長至最大密度之前,用新鮮的培養基稀釋培養物,每次稀釋反應器培養體積的1/2~3/4,以維持細胞的指數生長狀態,隨著稀釋率的增加培養體積逐步增加?;蛘咴诩毎鲩L和產物形成過程中,每隔一定時間,定期取出部分培養物,或是條件培養基,或是連同細胞、載體一起取出,然后補加細胞或載體,或是新鮮的培養基繼續進行培養的一種操作模式。剩余的培養物可作為種子,繼續培養,從而可維持反復培養,而無需反應器的清洗、消毒等一系列復雜的操作。在半連續式操作中由于細胞適應了生物反應器的培養環境和相當高的接種量,經過幾次的稀釋、換液培養過程,細胞密度常常會提高。
        2.半連續式特點:
        培養物的體積逐步增加;
        可進行多次收獲;
        細胞可持續指數生長,并可保持產物和細胞在一較高的濃度水平,培養過程可延續到很長時間。
        該操作方式的優點是操作簡便,生產效率高,可長時期進行生產,反復收獲產品,可使細胞密度和產品產量一直保持在較高的水平。在動物細胞培養和藥品生產中被廣泛應用。
        四、連續式培養(continuousculture
        1.連續式培養是一種常見的懸浮培養模式,采用機械攪拌式生物反應器系統。該模式是將細胞接種與一定體積的培養基后,為了防止衰退期的出現,在細胞達最大密度之前,以一定速度向生物反應器連續添加新鮮培養基;同時,含有細胞的培養物以相同的速度連續從反應器流出,以保持培養體積的恒定。理論上講,該過程可無限延續下去。
        2.連續培養的優點是反應器的培養狀態可以達到恒定,細胞在穩定狀態下生長。穩定狀態可有效的延長分批培養中的對數生長期。在穩定狀態下細胞所處的環境條件如營養物質濃度、產物濃度、pH值可保持恒定,細胞濃度以及細胞比生長速率可維持不變。細胞很少受到培養環境變化帶來的生理影響,特別是生物反應器的主要營養物質葡萄糖和谷氨酰胺,維持在一個較低的水平,從而使他們的利用效率提高,有害產物積累有所減少。然而在高的稀釋率下,雖然死細胞和細胞碎片及時清除,細胞活性高最終細胞密度得到提高;可是產物卻不斷在稀釋,因而產物濃度并為提高;尤其是細胞和產物不斷的稀釋,營養物質利用率、細胞增長速率和產物生產速率低下。
        3.連續式培養不足:
        由于是開放式操作,加上培養周期較長,容易造成污染;
        在長周期的連續培養中,細胞的生長特性以及分泌產物容易變異;
        對設備、儀器的控制技術要求較高。
        連續式培養操作使用的反應器多數是攪拌式生物反應器,也可以是管式反應器。
        4.連續式培養的特點:
        細胞維持持續指數增長;
        產物體積不斷增長;
        可控制衰退期與下降期。
        五、灌流式培養(perfusionculture
        1.灌流式培養是把細胞和培養基一起加入反應器后,在細胞增長和產物形成過程中,不斷地將部分條件培養基取出,同時又連續不斷地灌注新的培養基。它與半連續式操作的不同之處在于取出部分條件培養基時,絕大部分細胞均保留在反應器內,而半連續培養在取培養物時同時也取出了部分細胞。
        灌流式培養常使用的生物反應器主要有兩種形式。一種是用攪拌式生物反應器懸浮培養細胞,這種反應器必須具有細胞截流裝置,細胞截留系統開始多采用微孔膜過濾或旋轉膜系統,最近開發的有各種形式的沉降系統或透析系統。
        中空纖維生物反應器是連續灌流操作常用的一種。它采用的中空纖維半透膜,透過小分子量的產物和底物,截流細胞和分子量較大的產物,在連續灌流過程中將絕大部分細胞截留在反應器內;近年來中空纖維生物反應器被廣泛應用于產物分泌性動物細胞的生產,主要用于培養雜交瘤細胞生產單克隆抗體。
        另外一種形式是固定床或流化床生物反應器,固定床是在反應器中裝配固定的籃筐,中間裝填聚脂纖維載體,細胞可附著在載體上生長,也可固定在載體纖維之間,靠上攪拌中產生的負壓,迫使培養基不斷流經填料,有利于營養成分和氧的傳遞,這種形式的灌流速度較大,細胞在載體中高密度生長。流化床生物反應器是通過流體的上升運動使固體顆粒維持在懸浮狀態進行反應,適合于固定化細胞的培養。
        2.灌流式培養的優點:
        細胞截流系統可使細胞或酶保留在反應器內,維持較高的細胞密度,一般可達107-109/ml,從而較大的提高了產品的產量;
        連續灌流系統,使細胞穩定的處在較好的的營養環境中,有害代謝廢物濃度積累較低;
        反應速率容易控制,培養周期較長,可提高生產率,目標產品回收率高;
        產品在罐內停留時間短,可及時回收到低溫下保存,有利于保持產品的活性。
        連續灌注培養是近年用于動物細胞培養生產分泌型重組治療性藥物和嵌合抗體及人源化抗體等基因工程抗體較為推崇的一種方式。應用連續灌流工藝的公司有Genzyme,GeneticInstitute,Bayer公司等。這種方法最大困難是污染機率較高,長期培養中細胞分泌產品的穩定性,規模放大過程中工程問題。
        六、細胞工廠培養細胞工廠(cellfactory)是一種設計精巧的細胞培養裝置。它在有限的空間內利用了最大限度的培養表面,從而節省了大量的廠房空間,并可節省貴重的培養液。更重要的是,它可有效地保證操作的無菌性,從而避免因污染而帶來的原料、勞務和時間損失。它是對傳統轉瓶培養的革命。
        丹麥NUNC公司生產的NUNC細胞工廠是目前應用較多的細胞工廠系統??捎糜谌缫呙?、單克隆抗體或生物制藥等工業規模生產,特別適合于貼壁細胞,也可用于懸浮培養,在從實驗室規模進行放大時不會改變細胞生長的動力學條件,可提供1,2,1040盤的規格使放大變得簡單易行,低污染風險,節省空間,培養表面經測試保證最有利于細胞貼附和生長。同時,與NUNC的細胞工廠操作儀結合使用,可全面實現細胞培養的自動化,從而大大地減低勞動強度和密集度。
        這套系統使用很方便,可產生類似塑料培養瓶的效果。由組織培養級聚笨乙烯制成,使用后可隨意處理。其最大缺點是:經胰酶消化后,很難將細胞完全洗出。
        第四節動物細胞大規模培養用生物反應器簡介
        動物細胞培養技術能否大規模工業化、商業化,關鍵在于能否設計出合適的生物反應器(bioreactor)。由于動物細胞與微生物細胞有很大差異,傳統的微生物反應器顯然不適用于動物細胞的大規模培養。首先必須滿足在低剪切力及良好的混合狀態下,能夠提供充足的氧以供細胞生長及細胞進行產物的合成。
        一、生物反應器分類
        目前,動物細胞培養用生物反應器主要包括:轉瓶培養器、塑料袋增殖器、填充床反應器、多層板反應器、螺旋膜反應器、管式螺旋反應器、陶質矩形通道蜂窩狀反應器、流化床反應器、中空纖維及其它膜式反應器、攪拌反應器、氣升式反應器等。
        按其培養細胞的方式不同,這些反應可分為以下三類:
        1.懸浮培養用反應器:如攪拌反應器、中空纖維反應器、陶質矩形通道蜂窩狀反應器、氣升式反應器;
        2.貼壁培養用反應器:如攪拌反應器(微載體培養)、玻璃珠床反應器、中空纖維反應器、陶質矩形通道蜂窩狀反應器;
        3.包埋培養用反應器:如流化床反應器、固化床反應器。
        二、攪拌罐生長反應器這是最經典、最早被采用的一種生物反應器。此類反應器與傳統的微生物生物反應器類似,真對動物細胞培養的特點,采用了不同的攪拌器及通氣方式。通過攪拌器的作用使細胞和養分在培養液中均勻分布,使養分充分被細胞利用,并增大氣液接觸面,有利于氧的傳遞?,F已開發的有:籠式通氣攪拌器、雙層籠式通氣攪拌器、槳式攪拌器、海般式攪拌器等。
        三、氣升式生物反應器
        1979年首次應用氣升式生物反應器成功的進行了動物細胞的懸浮培養。氣升式生物反應器的話優點:
        罐內液體流動溫和均勻,產生剪切力小,對細胞損傷較??;
        可直接噴射空氣供氧,因而氧傳遞率較高;
        液體循環量大,細胞和養分都能均勻分布于培養液中;
        結構簡單,利于密封并降低了造價。
        常用的氣升式反應器有三種:內循環式氣升式、外循環式氣升式、內外循環式氣升式生物反應器。
        四、鼓泡式生物反應器
        與氣升式反應器相類似,是利用氣體鼓泡來進行供氧及混合,其設計原理與氣升式生物反應器也相同。
        五、中空纖維生物反應器用途較廣,既可用于懸浮細胞的培養,又可用于貼壁細胞的培養。其原理是:模擬細胞在體內生長的三維狀態,利用反應器內數千根中空纖維的縱向布置,提供細胞近似生理條件的體外生長微環境,使細胞不斷生長。中空纖維是一種細微的管狀結構,管壁為極薄的半透膜,富含毛細管,培養時纖維管內灌流充以氧氣的無血清培養液,管外壁則供細胞黏附生長,營養物質通過半透膜從管內滲透出來供細胞生長;對于血清等大分子營養物,劃必須從管外灌入,否則會被半透膜阻隔不能被細胞利用;細胞的代謝廢物也可通過半透膜滲入管內,避免了過量代謝物對細胞的毒害作用。
        優點是:
        占地空間少;
        細胞產量高,細胞密度可達109數量級;
        生產成本低,且細胞培養維持時間長,適用于長期分泌的細胞。
        六、生物反應器的設計和放大設計的總體考慮是:
        結構嚴密,能耐受蒸汽滅菌,采用對生物催化劑無害和耐蝕材料制作,內壁光滑無死角,內部附件盡量減少,以維持純種培養需要;
        有良好的氣-液接觸和液-固混和性能和熱量交換性能,使質量與熱量傳遞有效地進行;
        保證產物質量和產量前提下,盡量節省能源消耗;
        減少泡沫產生,或附有消沫裝置以提高裝料系數,并有必要可靠的參數檢測和控制儀表并能與計算機聯機。
        生物反應器的放大一種新的生物技術產品從實驗室到工業生產的開發過程中,會遇到生物反應器的逐級放大問題,每一級約放大10100倍。生物反應器的放大,表面看來僅是一個體積或尺度放大問題,實際上并不是那么簡單。
        反應器放大研究雖已提出了不少方法,但還沒有一種是普遍都能適用的。目前還只能是半理論半經驗的,即抓住反應過程中的少量關鍵性參數或現象進行放大。
        有關氧傳遞問題在生物反應器中,氧的傳遞速率要滿足細胞對氧的攝取速率,并使反應器中溶解氧的濃度CL要維持在一定水平上。這就是說,在穩態情況下,供氧與需氧間存在下列關系:KLa(C*-CL)=r
        此處,KLa為氧的傳遞系數;C*為相當氣相氧分壓的溶氧濃度,CL為培養液中溶氧濃度,r為攝氧率。
        影響供氧的因素從上式可知r=KLa(C*-CL);因此影響供氧的因素總體上講是KLaC*-CL值。
        要增大C*-CL,無非是增大C*值或降低CL值。增大C*的措施,有適當增加反應器中操作壓力和增大氣相中的氧分壓兩個方法。在實際操作中,反應器保持一定正壓,以防止大氣中的雜菌從軸封、閥門等處侵入,但在增加罐壓的同時,發酵代謝所產生的CO2也會更多地溶解于培養液而對發酵不利。至于CL值,一般不允許過分減小,因為細胞在生長中有一個臨界氧濃度,低于此臨界值,細胞的呼吸將受到抑制。
        影響KLa的因素大致可分為三個方面:一是反應器的結構,包括相對幾何尺寸的比例;二是操作條件,如攪拌功率或循環泵功率的輸入量,通氣量等;三是培養或發酵液的物理化學性質,如流變特性,特別是其粘度或顯示粘度、表面張力、擴散系數、細胞形態、泡沫程度等。
        生物反應器中的傳熱在細胞培養和發酵過程中,熱量的釋放是普遍存在的。這是因為在培養或發酵過程中細胞與周圍環境的物質產生新陳代謝,即發生異化(分解)作用和同化(合成)作用,而異化作用一般釋放能量,同化作用則是吸收能量。同化作用包括細胞生長、繁殖、產物形成所需能量來自細胞對培養基中的基質及營養成分的異化。從熱力學角度講,異化所產生能量必然應多于同化所需要能量,而多余的能量則轉化為熱能釋放到周圍環境中去。無論是涉及細胞或酶的反應中,釋放出的熱量都應及時移去,以免影響過程的正常進行,為此在生物反應器中一般都附有冷卻裝置。
        第五節微載體培養技術(microcarrierculturetechnique
        一、微載體培養應用此技術于1967年被用于動物細胞大規模培養。經過三十余年的發展,該技術目前已漸日趨完善和成熟,并廣泛應用于生產疫苗、基因工程產品等。微載體培養是目前公認的最有發展前途的一種動物細胞大規模培養技術,其兼具懸浮培養和貼壁培養的優點,放大容易。目前微載體培養廣泛用于培養各種類型細胞,生產疫苗、蛋白質產品,如293細胞、成肌細胞、Vero細胞、CHO細胞。
        使用較多的反應器有兩種:貝朗公司的BIOSTAT?B反應器,使用雙槳葉無氣泡通氣攪拌系統;NBS公司的CelliGen、CelliGenPlusTMBioflo3000反應器,使用Cell-lift雙篩網攪拌系統。兩種系統都能實現培養細胞和收獲產物的有效分離。
        二、微載體是指直徑在60-250μm,能適用于貼壁細胞生長的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。自VanWezelDEAE-SephadexA50研制的第一種微載體問世以來,國際市場上出售的微載體商品的類型已經達十幾種以上,包括液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。常用商品化微載體有三種:Cytodex1、2、3,CytoporeCytoline。
        微載體的大?。涸龃髥挝惑w積內表面積(S/F)對細胞的生長非常有利。使微載體直徑盡可能小,最好控制在100-200μm之間。
        微載體的密度:一般為1.03-1.05g/cm2,隨著細胞的貼附及生長,密度可逐漸增大。
        微載體的表面電荷:據研究,控制細胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質。若電荷密度太低,細胞貼附不充分,但電荷密度過大,反而會產生毒性效應。
        三、微載體培養原理與操作
        1.原理:其原理是將對細胞無害的顆粒-微載體加入到培養容器的培養液中,作為載體,使細胞在微載體表面附著生長,同時通過持續攪動使微載體始終保持懸浮狀態。
        貼壁依賴性細胞在微載體表面上的增殖,要經歷黏附貼壁、生長和擴展成單層三個階段。細胞只有貼附在固體基質表面才能增殖,故細胞在微載體表面的貼附是進一步鋪展和生長的關鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。細胞能否在微載體表面黏附,主要取決于細胞與微載體的接觸概率和相融性。
        2.攪拌轉速:由于動物細胞無細胞壁,對剪切力敏感,因而無法靠提高攪拌轉速來增加接觸概率。通常的操作方式是:在貼壁期采用低攪拌轉速,時攪時停;數小時后,待細胞附著于微載體表面時,維持設定的低轉速,進入培養階段。微載體培養的攪拌非常慢,最大速度75r/min。
        3.細胞與微載體的相融性,是與微載體表面理化性質有關。一般細胞在進入生理PH值時,表面帶負電荷。若微載體帶正電荷,則利用靜電引力可加快細胞貼壁速度。若微載體帶負電荷,因靜電斥力使細胞難于黏附貼壁,但培養液中溶有或微載體表面吸附著二價陽離子作為媒介時,則帶負電荷的細胞也能貼附。
        4.細胞在微載體表面的生長影響細胞在微載體表面生長的因素很多,主要有三個方面。
        在細胞方面,如細胞群體、狀態和類型。
        在微載體方面,如微載體表面狀態、吸附的大分子和離子;微載體表面光滑時細胞擴展快,表面多孔則擴展慢。
        在培養環境中,如培養基組成、溫度、pH、DC以及代謝廢物等均明顯影響細胞在微載體上的生長。如果所處條件最優,則細胞生長快;反之生長速度慢。
        5.微載體培養操作要點
        培養初期:保證培養基與微球體處于穩定的PH與溫度水平,接種細胞(對數生長期,而非穩定期)至終體積1/3的培養液中,以增加細胞與微載體接觸的機會。不同的微載體所用濃度及接種細胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微載體含量,更高的微載體濃度需要控制環境或經常換液。
        貼壁階段(3-8d)后,緩慢加入培養液至工作體積,并且增加攪拌速度保證完全均質混合。
        培養維持期:進行細胞計數(胞核計數)、葡萄糖測定及細胞形態鏡檢。隨意細胞增殖,微球變得越來越重,需增加攪拌速率。經過3d左右,培養液開始呈酸性,需換液:停止攪拌,讓微珠沉淀5min,棄掉適宜體積的培養液,緩慢加入新鮮培養液(37℃),重新開始攪拌。
        收獲細胞:首先排干培養液,至少用緩沖液漂洗1遍,然后加入相應的酶,快速攪拌(75-125r/min20-30min。然后解離收集細胞及其產品。
        微載體培養的放大:可以通過增加微載體的含量或培養體積進行放大。使用異倍體或原代細胞培養生產疫苗、干擾素,已被放大至4000L以上。
        四、微載體大規模細胞培養的生物反應器系統此技術大規模培養,細胞擴增的效率受到諸多因素的影響和限制,其中主要的限制性因素包括:細胞對剪切力的敏感性、氧的傳遞以及傳代和擴大培養等。而研制的各種類型生物反應器系統則可針對上述限制性因素,為微載體細胞培養與擴增提供低剪切力、高氧傳遞效率、易于細胞傳代等適宜的外部環境。已較多使用的微載體培養系統生物反應器,可以實行計算機控制操作,培養攪拌速度及懸浮均勻程度、溫度變化、PH穩定及溶氧供應(O2、N2、CO2、空氣四種純化氣體按比例調節)、罐壓、培養體積和通氣量等參數全部由電腦自動控制。因此,應用生物反應器系統進行微載體細胞大規模擴增具有明顯優勢,目前國外相繼研制了數種適合進行微載體大規模細胞培養的生物反應器系統,如攪拌式生物反應器系統、旋轉式生物反應器系統以及灌注式生物反應器系統等。
        1、攪拌式生物反應器系統攪拌式生物反應器系統在微載體細胞大規模擴增研究領域已有較長的研究歷史,但因該細胞培養系統容易產生過大的剪切力,從而限制了其應用范圍。盡管如此,由于該系統具有簡單、實用及價格低廉等特點,國內外仍有不少應用該系統成功進行細胞大規模擴增的研究報道。例如,WernerA2000年)成功地在該系統內進行了肝細胞大規模擴增的研究。
        2、灌注式生物反應器系統灌流培養是目前研究熱點之一。它的特點是不斷地加入新鮮培養基以及不斷地抽走含細胞代謝廢物的消耗培養基,使細胞得以在一個相對穩定的生長環境內增殖,即省時省力,又減少了細胞發生污染的機會,且可以提高細胞密度10倍以上。
        3、旋轉生物反應器近年來,旋轉生物反應器系統(RCCS)已經成為應用微載體技術進行細胞大規模擴增的一種較常用細胞培養系統。該系統是基于美國航空航天局為模擬空間微重力效應而設計的一種生物反應器。RCCS既可以用于微載體大規模細胞培養,又能在其內培育細胞與支架形成的三維空間復合體。至今,近百種組織細胞均在該系統內成功進行了大規模擴增。
        五、微載體培養優點
        表面積/體積(S/V)大,因此單位體積培養液的細胞產率高;
        把懸浮培養和貼壁培養融合在一起,兼有兩者的優點;
        可用簡單的顯微鏡觀察細胞在微珠表面的生長情況;
        簡化了細胞生長各種環境因素的檢測和控制,重現性好;
        培養基利用率較高;
        放大容易;
        細胞收獲過程不復雜;
        勞動強度??;
        培養系統占地面積和空間小。
        第五章常見組織細胞的培養方法
        體內組織細胞在體外培養時,所需培養環境基本相似,但由于物種、個體遺傳背景及所處發育階段等的不同,各自要求條件有一定差別,所采取的培養技術措施亦不盡相同,現介紹個別組織細胞培養的要點如下:
        第一節上皮細胞培養
        上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分,又由于癌起源于上皮組織,故上皮細胞培養特別受到重視。但上皮細胞培養中?;祀s有成纖維細胞,培養時生長速度往往超過上皮細胞,并難以純化,同時上皮細胞難以在體外長期生存,因此純化和延長生存時間是培養關鍵。
        體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜,因此培養在有膠原的底物上可能利于生長,另外人或小鼠表皮細胞培養在以3T3細胞為飼養層(用射線照射后)時,細胞易生長并可發生一定程度的分化現象。降低PH、Ca2+含量和溫度,向培養基中加入表皮生長因子,均有利于表皮細胞生長。
        以表皮細胞為例,用皮膚表皮和真皮分離培養法可獲得純上皮細胞,其法如下(黑木凳志夫1981
        1、取材:外科植皮或手術殘余皮膚小塊,早產流產兒皮膚更好,取角化層薄者,切成0.51平方厘米小塊。
        2、置0.02%EDTA中,室溫,5分鐘。
        3、換入0.25%胰蛋白酶中,4℃過夜。
        4、分離:取出皮塊,用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。
        5、取出表皮,剪成更小的塊后,置0.25%胰酶中,37℃,30—60分鐘。
        6、反復吹打,制成懸液。
        7、培養:用80目不銹鋼紗網濾過后,低速離心,吸去上清。
        8、直接加入培養基(Eagle20%小牛血清)制成細胞懸液,接種入培養瓶,CO2溫箱培養。
        第二節內皮細胞培養
        內皮細胞易于從大血管分離培養成單層細胞,對于研究內皮細胞再生、腫瘤促血管生長因子(TAF)等有很大價值。
        研究人內皮細胞培養以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡便,其法如下:
        1、產后新鮮臍帶,無菌剪取10—15厘米長一段,如不能立即培養,可于12小時內保存于4℃。
        2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血,在入口處用線繩扎緊,以防液體返流。
        3、用血管鉗夾緊臍帶一端,從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶,充滿血管,消化3—10分鐘;注入口用線繩扎,以防液體返流。
        4、吸出含有內皮細胞的消化液,于離心管中,注入溫PBS輕輕反復沖洗后,一并注入離心管中(此步驟可重復)。
        5、離心去上清,加入RPMI1640培養液制成細胞懸液,接種入培養器皿中,置溫箱培養。兩至三天可見細胞長成單層。
        第三節神經細胞培養
        神經細胞(神經元)不易培養,只有在適宜情況下,如接種在膠原底層上,或加入神經生長因子和膠質細胞因子時,可出現一定程度的分化,長出突起等現象,但很難使之增值。而神經膠質細胞是神經組織中比較容易培養的成分。
        人、鼠等腦組織即可用于神經膠質細胞培養,不僅能獲得生長的膠質細胞,也可形成能傳代的二倍體細胞系。一般說來,膠質細胞在培養中生長不穩定,不易自發轉化,但對外界因素仍保持很好的敏感性,可用ROUS病毒和SV4等誘發轉化。
        一.設備:無菌操作設備。
        二.大型設備CO2培養箱:恒溫5%、10%CO2維持培養液中pH值。
        倒置顯微鏡:用于每天觀察貼壁細胞生長情況。
        解剖顯微鏡,用于準確地取材。
        常溫冰箱:-4℃,用于保存各種培養液,解剖液和鼠尾膠。
        低溫冰箱:-20℃--80℃,用于儲存血清酶,貴重物品和試劑。
        電熱干烤箱:用于消毒玻璃器皿。
        高壓消毒鍋:用于消毒培養皿,手術器械。
        過濾器:配制解剖液、培養液,必須過濾后才可使用,以去除細菌。
        滲透壓儀,pH劑,天平等。
        三.培養器皿及手術器械
        1培養皿:常用35mm塑料及玻璃皿,解剖取材用15mm-90mm直徑。
        2培養板,24-40孔,可用于開放培養。
        3培養瓶:
        4吸管,常用1,5,10ml,均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。
        5各類培養液貯存器。
        6小型手術器械。
        準備:
        一配制培養液
        1)解剖液:以無機鹽(去除Ca2+,Mg2+)加葡萄糖配制成PBS緩沖液,保持一定的滲透壓和pH值。
        2)基礎培養基(MEM):主要為多種氨基酸,加入葡萄糖,雙蒸餾水溶解。
        3)接種培養液:用于胰酶消化后的細胞分散,做成細胞懸液,其成分為MEM1%谷氨酰胺,另加入10%馬血清,當天配制。
        4)維持培養液:接種后24h,全部換成此液,后每2周換一次,每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清,1%谷氨酰胺,及適量的支持性營養物質。
        二培養基質常用鼠尾膠、小牛皮膠,多聚賴氨酸,再涂膠
        三消毒培養皿的備用。所有培養器皿均需清水沖洗2-3d,達兩次ddH2O,每遍洗刷3-4次,加塞包裝,置于烤箱中干燥消毒,于培養前1天進行。
        神經細胞分散培養
        (一)選材常用胚胎動物或新生鼠神經組織。雞胚常用胚齡6-8d,新生鼠或胎鼠(12-14d)或人胚胎。不過也有認為與組織相關。如大白鼠胚胎以19d為宜,小鼠以18d為宜,大鼠紋狀體以10d為宜;若紋狀體與黑質聯合培養的大鼠胚,則黑質以13d,紋狀體18-21d為宜;小腦以20-21d小鼠胚胎,所獲蒲氏細胞成活率高,顆粒細胞正在分化;脊髓與DRG聯合培養,常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎,取材易,神經成活率高。
        (二)取材。腦則取出相應組織,在解剖液中先剪碎,以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上,用小刀將其要成背腹兩側,分別培養。
        (三)細胞分離與接種。神經組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min,移入接種液,停止消化,并洗去胰蛋白酶液,用細口吸管吹打細胞懸液,使其充分分散,如此多次,待沉淀后吸出上層細胞懸液,計數,預置細胞密度,接種于培養皿(1×106),做電生理應為5×105或更低。
        (四)抑制膠質細胞生長。培養3-5d后,也有人認為培養7d后,用阿糖胞苷,或5-FU抑制神經膠質細胞的生長。
        (五)觀察。接種6-12h,開始貼壁,并有集合現象,細胞生長突起明顯,5-7d膠質細胞增生明顯,7-10d膠質細胞成片于神經細胞下面,形成地毯,2周時神經細胞生長最豐滿,四周暈光明顯,一個月后,有些神經細胞開始退化,變形,甚至出現空泡,一般培養2-4周最宜。
        但神經細胞只能增大,而不能增殖,只能原代,不能傳代,不會有細胞周期,而且隨培養時間的延長,細胞數量在下降,但膠質細胞可以,神經膠質細胞也可以。在培養過程中,早期9-12d時,有較多的神經細胞死亡,這是第一次死亡階段,應注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細胞一般突起長而多,且相互形成突觸。
        (六)常用培養細胞實驗有:FCM的蛋白總量分析;膜片鉗與離子通道的分析;免疫組化分析;
        但免疫組化分析應注意,由于抗體直接作用于活細胞,不易穿透活細胞,故對核內抗原定位時,首先考慮膜對抗體的通透性問題。常用化學試劑以增加其通透性或采用冰凍方法解決。
        在免疫組化中,或其它組織學染色中,常用不同的染色方法以區分不同細胞,如半乳糖腦苷脂對小樹突膠質細胞標記明顯;GFAP對星形膠質細胞具有特異性染色等。這對研究神經系統中膠質細胞功能具有極大的應用價值。神經膠質細胞以往多被忽視,其在腦血管疾?。ㄈ缛毖該p傷)、退行性疾?。ㄈ?/span>AD、PD)、損傷后膠質細胞的填充等具有不可忽視的作用。它也是神經細胞功能和營養支持的物質基礎。
        第四節肌組織細胞培養
        各種肌組織均可用于培養,以心肌和骨骼肌較實用。
        (-)骨骼肌細胞培養
        1、出生12天的乳鼠,引頸處死。
        2、無菌取大腿肌組織,切成0.30.5cm2小塊后,用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化,無菌紗網或紗布濾過。
        3、計數調整細胞密度。
        4、快接種量2×106/皿入培養基培養。
        5、培養基內含10%小牛血清,可加1%的胎汁以促進分化。
        接種在膠原或膠原的底物上能促進細胞分化,明膠配置:用Hanks液配成0.01%明膠。
        該細胞接種率約50%,細胞生長開始呈紡錘形,培養5052小時后出現融合形成肌細胞狀多核纖維。數日后融合停止,此時可觀察到橫紋,一般在融合后二、三天內能見到收縮現象。
        (二)心肌細胞培養
        心肌細胞是最早的培養材料,Carrel曾長期培養過心肌組織,至今心肌仍不失為好的培養物,最常用的是雞胚心肌。
        心肌比較容易培養和生長,可用懸滴培養、組織塊培養和消化培養法,均可獲良好的效果。取心室肌培養較好,原代培養的雞胚心肌呈紡錘形,培養成功時,一周后可見節律性收縮現象。
        第五節巨噬細胞培養
        巨噬細胞屬免疫細胞,有多種功能,是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。巨噬細胞容易獲得,便于培養,并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群,在條件適宜下可生活23周,多用做原代培養,難以長期生存。
        巨噬細胞也建有無限細胞系,大多來自小鼠,如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等,均獲惡性,培養中呈巨噬細胞形態和吞噬功能,易于傳代和瓶壁分離,但難以建株。
        培養巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞,以小鼠腹腔取材法最為實用,其法如下:
        1、實驗前三天,向小鼠腹腔內注入無菌硫羥乙酸肉湯lml(勿注入腸內?。?,以刺流產生大量的巨噬細胞。
        2、引頸處死小鼠。
        3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中35秒。
        4、置動物于解剖臺,用針頭固定四肢,持鑷撕開腹部皮膚,但勿傷及腹膜壁,把皮膚拉向上下兩側,暴露出腹膜壁。
        5、用70%酒精擦洗腹膜壁,注射器吸10mlEagle液注入腹腔中,同時用手指從兩側壓揉腹膜壁,使液體在腹腔內流動。
        6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側.使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內。
        7、小心拔出針頭,把液體注入離心管。
        8、4℃250g離心10分鐘后,去上清,加10mlEagle培養基。
        9、計數細胞。每只鼠可產生2030×106細胞,其中90%為巨噬細胞。
        10、以3×105個貼附細胞/平方厘米接種。
        11、接種數小時后,除去培養液,可去除其它白細胞,純化培養細胞,用Eagle液沖洗12次,再加新Eagle培養液置CO2溫箱中。
        第六節腎小球分離、移植培養
        SD大鼠頸椎脫臼法處死,75%乙醇浸泡12分鐘,2次,置超凈臺內,打開腹腔取出腎臟剪碎,置含Hank&apos;s液的無菌培養皿洗滌,置80目不銹鋼篩網上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產物微小組織透過篩網,濾過組織Hank&apos;s液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網,濾過,去小組織塊,濾過物吸至200目不銹鋼篩網,輕輕濾過,Hank&apos;s液洗滌1次,收集網上腎小球,鏡下觀察為分離良好的腎小球。
        腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶,37℃消化20分鐘,加血清終止胰酶反應,離心除去膠原酶。處理過的腎小球計數后接種至24孔培養板或25ml培養瓶,使腎小球大于60/cm2,加培養基510ml(培養基組成:F12—3T3上清11;5%馬血清;2.5%胎牛血清;胰島素5μg/ml;25ng/ml氫化可的松;5μg/ml轉鐵蛋白;25ng/ml前列腺素E1;甲狀腺素0.02ng/ml;D-纈氨酸150ng/ml)腎小球培養810天,去除腎小球未生長組分,細胞繼續培養24小時,形態學觀察:細胞生長成單層多角型細胞,直徑約100μm。
        第七節裸小鼠移植瘤單細胞分離培養
        無菌條件下取出小鼠移植瘤組織,剪成1mm3小塊,用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時,再加等體積0.2%胰酶消化58分鐘,在消化過程中用吸管吹打組織塊或用自制裝置(分別作為加樣和收集器的兩個注射器中間加一小濾器連接而成,濾器中間墊兩層絲質材料以隔斷組織塊與單細胞)來回推動注射器吹打組織以分離單細胞,終止酶消化方法同上。
        常規方法接種培養收獲細胞。
        第六章腫瘤細胞的培養
        腫瘤細胞在組織培養中占有核心的位置,首先癌細胞是比較容易培養的細胞。當前建立的細胞系中癌細胞系是最多的。另外腫瘤對人類是威脅最大的疾病。腫瘤細胞培養是研究癌變機理、抗癌藥檢測、癌分子生物學極其重要的手段。腫瘤細胞培養對闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用。
        一、組織培養腫瘤細胞生物學特性
        腫瘤細胞與體內正常細胞相比,不論在體內或在體外,在形態、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長在體內的腫瘤細胞和在體外培養的腫瘤細胞,其差異較小,但也并非完全相同。培養中的腫瘤細胞具以下突出特點:
        (-)形態和性狀
        培養中癌細胞無光學顯微鏡下特異形態,大多數腫瘤細胞鏡下觀察比二倍體細胞清晰,核膜、核仁輪廓明顯,核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細胞表面的微絨毛多而細密,微絲走行不如正常細胞規則,可能與腫瘤細胞具有不定向運動和錨著不依賴性有關。
        (二)生長增殖
        腫瘤細胞在體內具有不受控增殖性,在體外培養中仍如此。正常二倍體細胞在體外培養中不加血清不能增殖,是因血清中含有很細胞增殖生長的因子,而癌細胞在低血清中(2%~5%)仍能生長。已證明腫瘤細胞有自泌或內泌性產生促增殖因子能力。正常細胞發生轉化后,出現能在低血清培養基中生長的現象,已成為檢測細胞惡變的一個指標。癌細胞或培養中發生惡性轉化后的單個細胞培養時,形成集落(克?。┑哪芰Ρ日<毎麖?。另外癌細胞增殖數量增多擴展時,接觸抑制消除,細胞能相互重疊向三維空間發展,形成堆積物。
        (三)永生性
        永生性也稱不死性。在體外培養中表現為細胞可無限傳代而不凋亡(Apoptosis)。體外培養中的腫瘤細胞系或細胞株都表現有這種性狀,體內腫瘤細胞是否如此尚無直接證明。因惡性腫瘤終將殺死宿主并同歸于盡,從而難以證明這一性狀的存在。體外腫癌細胞的永生性是否能反證它在體內時同樣如此?也尚難肯定。從近年建立細胞系或株的過程說明,如果永生性是體內腫瘤細胞所固有的,腫瘤細胞應易于培養。事實上,多數腫瘤細胞初代培養時并不那么容易。生長增殖并不旺盛;經過純化成單一化瘤細胞后,也大多增殖若干代后,便出現類似二倍體細胞培養中的停滯期。過此階段后才獲得永生性,順利傳代生長下去。從而說明體外腫瘤細胞的永生性有可能是體外培養后獲得的。從一些具有永生性而無惡性性的細胞系,如NIH3T3、Rat1、10T1/2等細胞證明,永生性和惡性(包括浸潤性)是兩種性狀,受不同基因調控,但卻有相關性??赡苡郎允羌毎麗鹤兊碾A段。至少在體外是如此。
        (四)浸潤性
        浸潤性是腫瘤細胞擴張性增殖行為,培養癌細胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養時,能浸潤入其它組織細胞中,并有穿透人工隔膜生長的能力。
        (五)異質性
        所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態等性狀不同的細胞組成。異質性構成同一腫瘤內細胞的活力有差別的瘤組織;處于瘤體周邊區的細胞獲得血液供應多,增殖旺盛,中心區有的細胞衰老退化,有的處于周期阻滯狀態,那些呈活躍增殖狀態的細胞稱干細胞(StemCells)、只有這些干細胞才是支持腫瘤生長的成分。腫瘤干細胞培養時易于生長增殖;把干細胞分離出來的培養方法稱干細胞培養。
        (六)細胞遺傳
        大多數腫瘤細胞有遺傳學改變,如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細胞群常由多個細胞群組成,有干細胞系和數個亞系,并不斷進行著適應性演變。
        (七)其它
        腫瘤細胞在體外不易生長的原因可能由于:
        依賴性:腫瘤細胞雖有較強克隆生長力,但仍有一定的群體性或與其它細胞相依存關系。一是腫瘤細胞與腫瘤細胞的相互依存,二是腫瘤細胞與基質成纖維細胞的依賴。體外分散培養和排除成纖維細胞后也會同時消除或減弱這些依存關系,可能影響癌細胞增殖生長的活性;
        腫瘤細胞的自泌也會因分散培養而被稀釋,達不到腫瘤生長的需求,降低腫瘤細胞的生長增殖力;
        并非所有腫瘤細胞都有強的生長活力和長的LifeSpan,只有干細胞才有強的增殖生長能力,但這些細胞數量很少;
        離體培養腫瘤細胞可能需求與體內相似的特殊生存條件。
        二、培養方法
        腫瘤細胞培養成功關鍵在于:取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養液和培養底物等幾個方面。在具體培養方法方面,腫瘤細胞培養與正常組織細胞培養并無原則差別,初代培養應用組織塊和消化培養法均可。
        1.取材:
        人腫瘤細胞來自外科手術或活檢瘤組織。取材部位非常重要,體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區,取材時盡量避免用退變組織,要挑選活力較好的部位。癌性轉移淋巴結或胸腹水是好的培養材料。取材后宜盡快進行培養,如因故不能立即培養,可貯存于4℃中,但不宜栽過24小時。
        2.培養基:
        腫瘤細胞對培養基的要求不如正常細胞嚴格,一般常用的RPMIl640、DMEM、Mc-Coy5A等培養基等皆可用于腫瘤細胞培養。腫瘤細胞對血清的需求比正常細胞低,正常細胞培養不加血清不能生長,腫瘤細胞在低血清培養基中也能生長。腫瘤細胞對培養環境適應性較大,是因腫瘤細胞有自泌(Autocrine)性產生促生長物質之故。但這并不說明腫瘤細胞完全不需要這些成分。按不同細胞需要不同的生長因子;腫瘤細胞與正常細胞之間、腫瘤細胞與腫瘤細胞之間對生長因子的需求都存在著差異。但大多數腫瘤細胞培養中仍需要生長因子。有的還需特異性生長因子〔如乳腺癌細胞等)??傊囵B腫瘤細胞仍需加血清和相關生長因子培養更易成功。
        3.成纖維細胞的排除:
        成纖維細胞常與腫瘤細胞同時混雜生長,致難以純化腫瘤細胞。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長得快,最終能壓制腫瘤細胞的生長。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養中的關鍵。排除成纖維細胞有多種方法(表21)。
        21抑制成纖維細胞生長因素
          方法 因素 組織細胞
        選擇性附著
        選擇性附著底物
        匯合飼細胞層
        選擇性培養基
           胰蛋白酶
        膠原酶
        聚丙烯酰胺
        聚四氟乙烯(Teflon
        膠原(豬皮)
        小鼠3T3
        人胎小腸
        D-纈氨酸(Valine
        MCDB-710
        MCDB-153
        Phenobarbitone 胚胎小腸、心肌、表皮
        乳癌
        各種腫瘤
        轉化細胞
        表皮細胞
        表皮
        正常和惡性乳腺上皮
        結腸癌
        腎組織
        乳腺
        表皮
        肝細胞
        注:上表結果為個別實驗室經驗,僅供參考
        三、成纖維細胞排除法
        1.機械刮除法:
        是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲)、或裹少許脫脂棉制成,裝入試管中高壓滅菌后備用(也可用特制電熱燒灼器刮除)。刮除程序為:
        1)標記:鏡下觀察,用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位;
        2)刮除:棄掉培養液,把無菌膠刮伸入瓶皿中,肉眼或顯微鏡窺視下,刮除無標記空間;
        3)用Hanks液沖洗一兩次,洗除被刮掉的細胞;
        4)注入培養液繼續培養,如發現仍有成纖維細胞殘留,可重復刮除至完全除掉為止
        2.反復貼壁法:
        根據腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點,并結合使用不加血清的營養液,把含有兩類細胞的細胞懸液反復貼壁,使兩類細胞相互分離,操作方法與傳代相同。
        1)待細胞生長達一定數量后,倒出舊培養液,用胰酶消化后,Hanks沖洗2次,加入不含血清的培養液,吹打制成細胞懸液;
        2)取編號為此A、B、C三個培養瓶;首先把懸液接種入A培養瓶中。置溫箱中靜止培養520分鐘后,輕輕傾斜培養瓶,讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養液,再接種入B培養瓶中后;向A瓶中補充少許完全培養液置溫箱中繼續培養;
        3)培養B瓶中細胞520分鐘后,接處理A的方法,把培養液注入C培養瓶中;再向B瓶中補加完全培養基。
        當三個瓶內都含有培養液后,均在溫箱中繼續培養。如操作成功,次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞,B瓶兩類細胞相雜,C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復處理多次,直至癌細胞純化為止。
        3.消化排除法:
        此法曾用于乳癌細胞的培養,具體程序是:
        1)先是用0.5%胰蛋白酶和0.02EDTA11)混合液漂洗培養細胞一次,然后再換成新的混合液繼續消化,并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養瓶,到半數細胞脫落下來后,便立即停止消化;
        2)把消化液吸入離心管中,離心去上清,吸入另瓶中,加培養液置溫箱中培養;向原瓶內也補加新的培養液繼續培養。用此法處理后,成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。經過幾次反復處理,可能把成纖維細胞除凈。
        4.膠原酶消化法:
        本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點,通過消化進行選擇。
        1)可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理,邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視,當發現成纖維細胞被除掉后,即終止消化;
        2)用Hanks洗滌處理一次后,更換新培養液,繼續培養,可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈,可再次重復。
        5.其它方法:
        有人發現聚丙烯酰胺有抑制成纖維細胞生長的作用;也有人用聚蔗糖制備成比重1.0251.085的密度梯度離心液,加入細胞懸液后,在23℃800g離心10分種。在比重1.0251.050層為成纖維細胞,在比重1.0501.085層為上皮細胞,再經過分離進行培養。最近也有人應用特殊化學物如SOD抑制成纖維細胞生長的方法。
        選用上述任何一種方法,都需進行試驗,取得必要經驗,找出適合的條件,才能獲得好的效果。
        四、提高腫瘤細胞培養存活率和生長率措施
        根據人們的經驗,腫瘤細胞在體外不易培養,建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。當腫瘤組織或細胞初代接種培養后,常出現以下幾種情況:
        完全無細胞游出或移動;
        有細胞移動和游出,但無細胞增殖,細胞長時間處于停滯狀態以致難以傳代;
        有細胞增殖,傳若干代后停止生長或衰退死亡;
        傳數代后細胞增殖緩慢,經過一段停滯期后,才又呈旺盛生長狀態,形成穩定生長的腫瘤傳代細胞系。
        以上現象說明腫瘤細胞對體外生存條件有較高的要求,并需經過對新環境的適應才能生長,因此欲獲得好的培養效果,不能局限于一般培養法,必須采用一些特殊的措施。
        1.適宜底物:把經過純化的細胞接種在不同的底物上,如鼠尾膠原底層、飼細胞層等。
        2.生長因子:應用促細胞生長因子,向培養液中增加一種或幾種促細胞生長因子。根據細胞種類不同選用不同的促生長物,常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。
        為提高腫瘤細胞對體外培養環境的適應力和增加有活力癌細胞(干細胞)的數量,可采用動物體轉嫁接種成瘤后,再從動物體內取出進行培養,能提高體外培養的成功率。受體動物以裸鼠最好。
        3.動物體媒介培養方法:
        1)瘤塊接種:取新鮮瘤組織,用Hanks液洗凈血污,切成13毫米小塊,用穿刺針頭吸一小瘤塊,用酒精棉球擦拭動物腹部后,直接刺入皮下,注入瘤塊;
        2)飼養觀察,待腫瘤生長達較大體積后,剝取出瘤組織;
        3)進行體外培養。
        4)為防止失敗,仍取部分瘤組織繼續在裸鼠體內傳代。通過裸鼠媒介接種,有活力的腫瘤細胞數量增多,細胞培養易于成功。
        腫瘤細胞培養方法與培養正常細胞完全相同,但成功率比正常細胞高。
        五、體外培養腫瘤細胞生物學檢測
        一旦培養的腫瘤細胞生長成形態上單一的細胞群體或細胞系(或株)后,不論用于實驗研究還是建立細胞系,都需要做一系列的細胞生物學測定,主要的目的在于求得證明:
        所培養的細胞系的確來源于原體內具有惡性的細胞,而非正常細胞或其它細胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學性狀。測定項目數量無明確規定,根據需要而定,以下為常做的項目和要點。
        【形態觀察】主要觀察細胞的一般形態,如大體形態、核漿比例、染色質和核仁大小、多少等以及細胞骨架微絲微管的排列狀態等。
        【細胞生長增殖】檢測細胞生長曲線、細胞分裂指數、倍增時間、細胞周期時間。
        【細胞核型分析】檢測核型特點,染色體數量、標記染色體的有無、帶型等。
        【凝集試驗】檢測凝集力。
        【軟瓊脂培養】檢測集落形成能力。
        【異體動物接種】向異體動物體內(皮下)接種細胞懸液,觀察成瘤能力。
        【其它】除上述項目外,根據需要還可做同位素標記、組織化學成分分析,熒光顯微鏡觀察等。
        在上述腫瘤細胞生物學檢測中,最主要的為:異體動物(以用裸鼠為上)接種成瘤、軟瓊脂培養、核型分析、細胞骨架和電鏡觀察等幾項。當然從分子細胞學角度考慮尚應做癌基因和抗癌基因等的檢測,這些項目將在本書第二篇中介紹。
        六、對腫瘤細胞系或細胞株的評價
        已建成的各種腫瘤細胞系或細胞株,無疑都是可用的實驗對象。近年我國已建成的腫瘤細胞系已非常多,并獲得越來越廣泛的應用。但根據研究者的經驗,在使用這些細胞系時,應持特別審慎態度,主要是應考慮到這些細胞在長期傳代中有否發生遺傳性改變的可能。眾所周知,長期傳代細胞系染色體核型常是不穩定的。另外也可能發生如基因突變、基因易位或缺失等變化。其結果可能導致細胞產生生物學性狀上的變動。以近年建成的各種腫瘤細胞系為例,都已傳代少則幾十,多則百代以上后,才確認建成了細胞系。這種情況下很難保證細胞從初代到建成時的性狀仍是一致的。
        已如前述,癌細胞在培養中并非能很順利地傳下去,凡已長期傳代的細胞系,都已獲得不死性。當前尚未完全確證所有癌細胞都具有不死性;因此尚難肯定在長期培養中的癌細胞的生物學性狀與體內時仍完全相同(包括不死性)。據上述對用癌細胞系所獲實驗結果應盡量做分析性的結論,避免做概括性的與體內等同的結論,外推與體內等同更是不妥的。廣泛來說,應用各種較長時間培養細胞做實驗時,都應如此。

         

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